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储粮害虫的为害、抗性问题已在仓储行业内引起高度重视。植物精油因其广谱、安全、在环境中低残留及害虫不易产生抗药性等优点,成为储粮害虫防治领域的研究热点。昆虫体内细胞色素P450(P450)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和酯酶(EST)等参与了植物精油及其活性成分的降解,但作用机理尚未明确。此类代谢反应导致植物精油作用缓慢、稳定性差,成为制约植物精油广泛应用于农业生产的重要问题。课题组前期研究明确茶树精油及其主要活性成分4-松油醇对储粮害虫具有显著的熏蒸活性。在此基础上,本研究通过点滴法测定细胞色素P450抑制剂增效醚对4-松油醇熏蒸玉米象的增效作用,明确P450酶系在调控玉米象应答4-松油醇中的作用,基于RNA-seq及生物信息学分析,筛选表达量显著上调的P450基因,探讨P450受4-松油醇诱导的响应模式,并通过RNAi技术验证靶标基因在玉米象对4-松油醇敏感性变化中的功能。研究结果为明确储粮害虫对4-松油醇的应答机制奠定理论基础,并为将茶树精油开发成绿色环保的新型储粮杀虫剂提供科学依据。主要研究结果如下:1、增效醚对4-松油醇熏蒸玉米象的增效作用细胞色素P450抑制剂增效醚(PBO)对4-松油醇熏蒸玉米象的增效作用结果表明,PBO对玉米象体内P450酶活性的抑制效果具有明显的时间效应,持效性达12 h;在0.3μg/头PBO剂量下处理玉米象12 h,试虫死+亡率显著增高,增效比(SR)为3.5。可见,细胞色素P450酶系在玉米象应答4-松油醇胁迫过程中扮演重要角色。2、玉米象应答4-松油醇的转录水平分析及主要解毒酶基因鉴定通过RNA-seq技术,对玉米象应答4-松油醇熏蒸胁迫的转录水平进行了功能注释及通路分析。结果表明,经组装拼接后共获得36,117个Unigenes;与Nr、Nt、Swissprot蛋白、KEGG、KOG、InterPro和GO数据库blast 比对,成功注释的基因分别为 19,841、4,697、14,744、14,970、14,275、15,524 和 5,401 个。基于 Nr 注释结果,发现54.79%的Unigenes与中欧山松大小蠢同源性最高。基于blast和passway通路分析,筛选出592个DEGs,与解毒代谢相关的主要包括:16个P450基因,8个GST基因,14个EST基因,10个葡萄糖基转移酶(UGT)基因和2个ABC转运蛋白基因,log2倍数在-2.57至-1和1至4.21范围。其中,P450基因差异表达最多、上调水平相对显著,在调控玉米象代谢4-松油醇中起重要作用。3、玉米象P450基因受4-松油醇诱导的响应模式解析基于转录组学测序结果,利用RT-qPCR检测16个P450基因在mRNA水平的表达模式。结果表明,P450基因在4-松油醇不同处理浓度(LC2G、LC50和LC80)下均呈显著上调趋势,上调倍数与处理浓度表现为正相关,总体上随处理时间递增均表现为过表达现象,具有明显的时间和剂量效应。其中,Unigene5887 All和CL4511.Contig3_All上调水平相对显著,推测为调控玉米象对4-松油醇解毒代谢的关键基因。4、与4-松油醇胁迫相关的P450还原酶基因和P450基因的生物信息学分析针对Unigene5887_All和CL4511.Contig3_All基因,通过克隆获得了相应的cDNA全长序列并分别命名为CYP4D V2和CYP6MS1,并将细胞色素P450还原酶基因命名为SzCPR。生物信息学分析结果表明,SzCPR有SzCPR-X1和SzCPR-X2两个转录本,均存在铆钉区域、FMN、FAD和NADP结合位点等4个功能域。CYP4DV2和CYP6MS1分别属于CYP4家族和CYP6家族,均具有P450大家族特征,属于微粒体型细胞色素P450基因。5、基于RNAi的SzPCR和P450基因在玉米象对4-松油醇敏感性中的作用研究建立了饲喂法沉默玉米象体内靶标基因的RNAi体系。研究RNAi后试虫对4-松油醇敏感性变化结果表明,分别沉默SzCPR、CYP6MS1后,玉米象对4-松油醇(LC30)的敏感性显著增加,死亡率分别提高了 25%、27%(p<0.05);饲喂dsCYP4DV2的玉米象经4-松油醇处理后死亡率增加10%,但与对照组无显著性差异。可见,SzCPR和CYP6MS1介导了玉米象对4-松油醇的敏感性,在解毒代谢过程中可能发挥重要作用。