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猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV）引起的猪繁殖障碍重大传染性疾病之一,已造成世界养猪业巨大经济损失。PRRSV M蛋白是欧洲型和美洲型毒株间最保守的蛋白,并且M蛋白不但能够诱导产生部分中和抗体,而且与细胞免疫应答有关。本研究的目的是利用基因操作技术把M蛋白的基因克隆入腺病毒表达载体系统中,构建成重组腺病毒,并检测其免疫效果,为研究PRRSV结构蛋白的功能与基因疫苗奠定基础。 根据GeneBank数据库中的PRRSV国内分离株S1株基因序列（No.AF090173）设计了一对针对M蛋白的基因引物,并在其5′含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。用RT-PCR技术从S1株中扩增大小为530bp的PCR产物,PCR产物经纯化后与穿梭载体pShuttle-CMV分别进行YpnⅠ和XhoⅠ酶双酶切,琼脂糖凝胶试剂盒回收酶切产物,T4 DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,涂布于卡那霉素抗性平板,在卡那霉素抗性（Kanr）平板上挑取阳性菌落;提取质粒经PCR,KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,DAN序列测序和DNAStar软件分析。结果表明:扩增片段与预期片段大小相符,而且完全符合载体阅读框,与S1株基因符合率为99%。构建的重组穿梭载体pShuttle-CMV-M经PmeⅠ酶切线性化,电转化转化到含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌菌株BJ5183中,在BJ5183内重组酶的作用下,线性化的pShuttle-CMV-M与超螺旋的骨架载体phdEasy-1在两个质粒同源序列部位发生同源重组,从而使所克隆的M基因进入腺病毒骨架载体。重组质粒在卡那霉素的LB平板上进行阳性菌落初步筛选,然后利用PacⅠ酶单酶切鉴定重组质粒。鉴定正确的重组质粒再次转化到DH5α感受态细胞,大量提取重组质粒,经PacⅠ酶酶切线性化,酚:氯仿抽提,无水乙醇沉淀后在超净台中用灭菌的双蒸水溶解。阳离子脂质体将线性化的重组质粒转染入293细胞,转染的细胞于37℃,5%的CO2温箱培养,10-15天,当出现明显的细胞病变时,收获病毒,获得的重组腺病毒经噬斑纯化后检测其组织细胞半数感染量(TCID50),TCID50是10-7.6/ml。RT-PCR和间接免疫荧光（IFA）试验鉴定结果表明M蛋白的基因能够在重组腺病毒中转录和表达。将重组腺病毒（rAd-M）于293细胞连续传代至第25代,结果第5、10、15、20、25代病毒TCID50分别为10-7.6/mL、10-8.1/mL、