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硒是人体必需的微量元素之一,大量的流行病学及临床数据表明它具有预防和治疗前列腺癌,肺癌,肝癌,等多种恶性肿瘤的作用,探究硒的抗癌分子机制是目前研究的热点。结直肠癌是一种常见的胃肠道恶性肿瘤,在我国发病率逐年增加,治愈率低。研究亚硒酸钠治疗结直肠癌的分子机制及开发硒化合物治疗结直肠癌具有重要的意义。实验前期结果表明：超营养剂量(10μmol/L)的亚硒酸钠能够抑制多株结肠癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡,同时亚硒酸钠在体内能抑制结肠癌移植瘤的生长,并诱导肿瘤组织凋亡。但是关于亚硒酸钠诱导结直肠癌细胞及组织凋亡的详细分子机制还不清楚。本研究在前期工作基础上深入研究了亚硒酸钠诱导结直肠癌细胞凋亡的分子机制。β-catenin蛋白在大部分结直肠癌细胞中都是异常积累的,是结直肠癌细胞生存和增殖的重要调控分子。我们首先采用免疫荧光,报告基因实验,免疫印迹(western blot)等多种检测手段分析亚硒酸钠处理的细胞中β-catenin定位和活性变化,结果得出亚硒酸钠抑制β-catenin在细胞核内积累和转录活性,并导致其靶基因表达的下调。然后分析了AKT这一重要的促肿瘤存活因子对β-catenin及其靶基因表达的调控作用。从western blot和AKT活性试验结果得出亚硒酸钠能够抑制AKT的激活。通过抑制或者激活AKT后用亚硒酸钠处理细胞,western分析p-AKT, p-β-catenin及其靶基因的表达变化,发现亚硒酸钠引起的AKT活性的下降直接导致了β-catenin在552位磷酸化下降,从而使其靶基因cyclin D1,survivin表达下降；过表达β-catenin后,亚硒酸钠诱导的细胞凋亡在一定程度被抑制说明亚硒酸钠调控的AKT/β-catenin通路参与了结肠癌细胞凋亡。进一步发现亚硒酸钠能够通过引起AKT的上游调控分子PTEN/PI3K/PDK1活性的改变。一方面亚硒酸钠能通过阻止PI3K/PDK1的激活来抑制AKT,另一方面硒也能促进PTEN的活性来负调控PI3K/AKT通路。在亚硒酸钠处理的结肠癌细胞中,AKT被抑制后,其下游的FoxO家族蛋白的抑制型磷酸化表达降低,尤其是FoxO3a在核内的积累随着亚硒酸钠的处理明显增多,表明它们被亚硒酸钠激活。特异性抑制或激活AKT后,从western blot结果中看出FoxO3a的磷酸化及下游的Bim表达都随着AKT的活性改变而改变。同时western blot和流式细胞仪检测结果都得出细胞凋亡的变化直接受到AKT/FoxO3a的调控。通过ChIP实验得出当FoxO3a被激活入核后与Bcl-2家族的Bim基因的启动子结合增强,促进其转录和表达。而用western blot和免疫荧光分析Bim蛋白在细胞质及线粒体上的分布情况,发现亚硒酸钠诱导的Bim能够从细胞质转位至线粒体。JC-1染色法测定结果表明亚硒酸钠能引起细胞内线粒体膜电位的丧失,RNA干扰实验特异性沉默Bim的表达后在一定程度阻止细胞凋亡的发生,证明亚硒酸钠诱导的的Bim参与了细胞凋亡。同时,在ChIP实验中发现亚硒酸钠能增强FoxO3a结合到PTEN的启动子上,促进PTEN的转录和表达,而通过干扰及抑制剂等实验也发现诱导表达的PTEN能进一步调控AKT/FoxO3a通路,放大亚硒酸钠的促凋亡效应。活性氧(ROS)是硒化合物诱导肿瘤细胞发生凋亡的重要调控分子,因此我们用DCFH-DA探针检测亚硒酸钠对结直肠癌细胞中ROS的影响,发现HCT116和SW480细胞中ROS水平随着亚硒酸钠处理时间的延长不断升高。用活性氧清除剂MnTMPyP清除活性氧以后能够阻止亚硒酸钠引起的AKT/β-catenin/FoxO3a信号通路变化及细胞凋亡。这些结果表明ROS是亚硒酸钠引起结直肠癌细胞凋亡及AKT/β-catenin/Fox03a信号分子变化的重要上游调控分子。此外,采用western blot及免疫组化等方法对裸鼠结肠癌移植瘤的组织样本进行分析,得出亚硒酸钠能诱导同细胞水平相似变化趋势的组织水平AKT/β-catenin/FoxO3a等相关信号分子的变化。这些结果进一步支持了研究结论：亚硒酸钠能够在体外和体内同时诱导结肠癌细胞或组织发生AKT/β-catenin/FoxO3a信号通路调控的细胞凋亡。最后我们初步分析了亚硒酸钠对结直肠癌细胞自噬的影响,通过vestern blot.透射电镜,GFP-LC3转染等实验发现亚硒酸钠能够诱导结直肠癌细胞内部自噬,用3-MA, Bafiloymycin A1等自噬抑制剂抑制细胞自噬后,亚硒酸钠诱导的凋亡增强,而当自噬被雷帕霉素(rapamycin)进一步激活后在一定程度阻止亚硒酸钠诱导的细胞凋亡。这些结果初步说明亚硒酸钠诱导的HCT116和SW480细胞自噬具有促进细胞存活的作用。但是其详细的分子机制还有待进一步深入的研究。我们的研究结果为筛选亚硒酸钠杀伤结直肠癌等肿瘤细胞的分子靶标提供了全新的视角,为开发硒化合物作为治疗肿瘤药物提供了重要的依据,也为硒对肿瘤的预防和治疗作用提供新的理论支撑,最后为硒的临床转化提供了重要的理论和实验基础。