本研究拟从体内体外水平研究上述问题，探讨TLR4表达及信号异常在腹膜透析相关性腹膜炎发生中的作用。 第一部分血管紧张素2诱导的TLR4表达在LPS诱导腹膜间皮细胞CD40表达中的作用 目的： 观察血管紧张Ⅱ对原代培养大鼠腹膜间皮细胞Toll样受体4表达的影响及其在脂多糖(LPS)诱导的核转录因子κB活化及CD40表达中的作用。 方法： 分离及培养RPMC。用不同浓度AngⅡ刺激细胞及用10-7mol/L AngⅡ刺激细胞不同时间，观察血管紧张素1型受体阻滞剂洛沙坦和血管紧张素2型受体阻滞剂PD123177对AngⅡ诱导TLR4表达的影响。将细胞随机分为下列4组：对照组、AngⅡ组、LPS组、AngⅡ+LPS组。RT—PCR检测TLR4、CD40mRNA表达；Western印迹检测TLR4、IκBα、磷酸化IκBα、NF—κB p65、磷酸化NF—κB蛋白表达；免疫荧光检测细胞NF—κB p65亚单位的表达及分布。 结果： (1)TLR4 mRNA表达高峰为8h和12h，蛋白表达高峰为12h和24h。(2)洛沙坦阻断后AngⅡ诱导的TLR4表达与未阻断组比较下调32.9±2.8％，PD123177对AngⅡ诱导的TLR4表达无显著影响。(3)与LPS组比较，AngⅡ预刺激24 h加LPS作用60min，IL—6mRNA表达上调。(4)免疫荧光结果显示正常对照组与AngⅡ组细胞中，p65信号定位于细胞胞质；LPS作用60min，p65信号从胞质进入胞核；AngⅡ+LPS组NF—κB p65胞核信号显著增强；(5)与正常对照组比较，LPS作用60min可显著上调p—IκBα/IκBα、p—p65/p65；作用4h显著上调CD40mRNA的表达，作用2h显著上调TNF—α，IL—6mRNA的表达。 结论： AngⅡ呈浓度、时间依赖性诱导RPMC TLR4表达，并显著增强LPS诱导NF—κB激活及CD40、TNF—α和IL—6的表达。提示腹膜组织局部产生的AngⅡ可能对LPS诱导的腹膜组织炎性反应具有放大作用。 第二部分葡萄糖腹透液和艾考糊精腹透液对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4表达及配体诱导MAPK、NF—κB信号激活和IL-1β、TNF—α表达的影响 目的： 观察不同浓度葡萄糖腹膜透析液、艾考糊精腹膜透析液对人腹膜间皮细胞TLR2和TLR4表达的影响及其对腹膜间皮细胞TLR2配体和TLR4配体诱导MAPK、NF—κB信号活化及IL-1β、TNF—αmRNA表达的影响 方法： 1.人腹膜间皮细胞株HMrSV5常规培养，DMEM/F12+10％胎牛血清。 2.不同浓度葡萄糖腹透液、艾考糊精腹透液对腹膜间皮细胞TLR2/4表达的影响：细胞生长至融合状态时，同步化培养24h。四唑盐比色法检测细胞活力。各组受试因素分别作用24、48、72h收集细胞，提取总蛋白用于检测TLR2和TLR4的表达水平；并于48h收集细胞用直接免疫荧光法检测TLR2和TLR4的表达及分布。 3.不同浓度葡萄糖腹透液、艾考糊精腹透液对腹膜间皮细胞TLR2/4配体(Pam3CSK4/LPS)诱导MAPK，NF—κB信号的影响：细胞生长至融合状态时，同步化培养24h。将细胞随机分为下列5组。透析液作用48h后，分别用Pam3CSK4/LPS刺激细胞60min。Western印迹检测p—p38、p38、p—ERK1/2、ERK1/2、p—JNK、JNK、p—p65、p65的表达。 4.不同浓度葡萄糖腹透液、艾考糊精腹透液对腹膜间皮细胞TLR2配体和TLR4配体(LPS)诱导IL-1β、TNF—αmRNA表达的影响：细胞生长至融合状态，同步化培养24h。将细胞随机分为下列5组：1.5％Dextrose、2.5％Dextrose、4.25％Dextrose、7.5％Icodextrin、无血清DMEM培养基对照组。透析液作用48h后，分别用Pam3CSK4、LPS刺激细胞2h。荧光定量PCR检测IL-1β、TNF—αmRNA的表达。 结果： 1.不同浓度葡萄糖腹透液、艾考糊精腹透液对腹膜间皮细胞活力的影响24h低糖组、中糖组、高糖组、糊精腹透液组细胞存活率分别为98.4±3.9％、99.4±7.3％、72.0±l6.2％、98.1±6.2％；48h低糖组、中糖组、高糖组、糊精腹透液组细胞存活率分别为94.4±11.4％、92.7±9.2％、71.2±7.0％、94.8±8.1％：72h低糖组、中糖组、高糖组、糊精腹透液组细胞存活率分别为73.4±3.9％、79.3±9.4％、60.5±5.4％、79.5±7.1％ 2.不同腹透液对TLR2和TLR4表达的影响：不同浓度葡萄糖腹透液作用24h对腹膜间皮细胞TLR2/4的表达无明显影响。作用48h，与对照组比较，低糖组、中糖组和高糖组TLR2表达分别降低5.5±2.8％、31.4±7.5％、54.9±1.9％，TLR4表达分别降低32.9±17.6％、47.7±13.5％、66.4±13.5％；艾考糊精组TLR2和TLR4表达分别下降4.4±4.5％，和8.9±8.6％，与对照组比较无显著差异。作用72h，与对照组比较，低糖组、中糖组、高糖组TLR2表达分别降低29.4±14.7％、38.9±9.9％和63.5±16.5％，TLR4表达分别降低59.5±16.8％、63.1±9.5％和79.2±14.0％；艾考糊精组TLR2和TLR4表达分别下降5.3±3.3％和1.2±11.9％，与对照组比较无显著差异。 3.不同浓度葡萄糖腹透液、艾考糊精腹透液作用腹膜间皮细胞48h后，分别用Pam3CSK4/LPS刺激细胞60min。Western印迹结果显示，与对照组比较，低糖组、中糖组、高糖组磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK、磷酸化p38、磷酸化NF—κB p65均明显降低，非磷酸化ERK1/2、非磷酸化JNK、非磷酸化p38、非磷酸化p65均无明显改变，表明葡萄糖透析液刺激间皮细胞后，细胞对Pam3CSK4/LPS诱导的MAPK、NF—κB信号减弱。艾考糊精透析液作用48h，与对照组比较，细胞对Pam3CSK4/LPS诱导的MAPK、NF—κB信号无明显改变。 4.不同浓度葡萄糖腹透液、艾考糊精腹透液作用腹膜间皮细胞48h后，分别用Pam3CSK4和LPS刺激细胞2h。PCR结果显示，与对照组比较，低糖组、中糖组、高糖组IL-1β、TNF—αmRNA表达明显降低；艾考糊精腹透液作用48h，与对照组比较，细胞对Pam3CSK4和LPS诱导的IL-1β、TNF—αmRNA表达无显著影响。 结论： 葡萄糖透析液显著抑制人腹膜间皮细胞TLR2和TLR4的表达及其信号转导，导致腹膜间皮细胞对病原微生物相关分子刺激的低反应性；艾考糊精透析液对TLR2和TLR4的表达、配体诱导信号转导及下游效应分子无显著影响。 第三部分持续不卧床腹膜透析相关性急性腹膜炎患者外周血、透出液中单核/巨噬细胞TLR2和TLR4的表达及促炎症因子合成能力的变化 目的： 探讨持续不卧床腹膜透析相关性腹膜炎患者是否存在与Toll样受体相关的天然免疫应答缺陷 方法： 26例CAPD相关性腹膜炎患者、12例CAPD无腹膜炎对照患者被纳入该研究。流式细胞仪检测外周血、透出液中单核细胞/巨噬细胞表面TLR2、TLR4的表达。外周血和分离的透出液巨噬细胞，在体外条件下用TLR2的受体激动剂，TLR4的受体激动剂LPS分别刺激细胞，用流式细胞仪细胞因子内染色的方法检测经刺激细胞促炎症因子肿瘤坏死因子—α和白细胞介素的表达。 结果： 腹膜炎患者透出液中巨噬细胞表面TLR4表达较对照患者显著降低，且巨噬细胞TNF—α的表达较对照患者明显下降。TLR4表达降低与巨噬细胞合成TNF—α下降显著相关；IL—6的表达与对照患者比较无显著变化。腹膜炎患者透出液中巨噬细胞表面TLR2表达与对照患者比较无明显变化。外周血单核细胞表面TLR2、TLR4的表达及经Pam3CSK4、LPS刺激后细胞TNF—α和IL—6的表达与对照患者比较均无明显变化。 结论： CAPD相关性腹膜炎患者腹腔巨噬细胞而并非外周血单核细胞合成TLR4受体依赖的促炎症因子能力下降，提示其腹腔局部天然免疫防御能力受损。巨噬细胞TLR4表达降低参与腹膜炎的发生，可能是腹膜炎发生的易感因素之一。 全文总结： 1.通过体外实验发现：血管紧张素Ⅱ上调大鼠腹膜间皮细胞TLR4的表达，增强LPS诱导的NF—κB活化、CD40、TNF—α、IL—6的表达。腹膜局部产生的AngⅡ可能对细菌内毒素诱导的腹膜炎症具有放大作用。 2.体外细胞研究发现：葡萄糖透析液可下调入腹膜问皮细胞TLR2和TLR4的表达，导致腹膜间皮细胞对病原微生物相关分子刺激的低反应性。传统的葡萄糖透析液可能通过下调表达腹膜问皮细胞TLR2和TLR4这一新的机制促使腹膜局部的防御功能下降。艾考糊精透析液对TLRs介导的腹腔局部免疫防御机制无显著影响。 3.临床观察研究发现：CAPD相关性腹膜炎患者腹腔巨噬细胞而并非是外周血单核细胞合成TLR4受体依赖的前炎症因子能力下降，提示其腹腔局部免疫防御能力受损。