现代药物治疗是一个个体化靶向治疗的时代,随着人类基因组学的发展,基于遗传学基础的药物基因组学也得到了迅速的发展。药物基因组学是研究遗传因素与药物反应相互关系的一门学科,为个体化治疗提供遗传学证据。传统药物治疗方法是测定血药浓度,计算药代动力学参数,确定个体化的给药方案,这一方法对于血药浓度与药效相一致的药物是可行的；对于诊断、一般状况、血药浓度相同而疗效和不良反应有差异的患者,用传统的方法就无法解释。20世纪50年代有学者发现不同个体的遗传背景对药物的反应有所不同,1959年正式提出了药物基因组学的概念。药物基因组学在一定程度上解释了血药浓度相同而药物疗效和不良反应存在差异的原理。到20世纪90年代随着人类基因组学的发展,药物基因组学也得到了迅速的发展。研究的基础也深入到单个核苷酸(SNPs)的差异。由于药物的遗传多样性对药物体内代谢、临床疗效和不良反应有很重要的影响,美国食品药品监督管理局(FDA)要求药物的应用应考虑所投放地区人群的等位基因频率,医疗处方也需根据个体的遗传特征个性化。迄今为止,上百种药物被美国FDA贴上了遗传标签。本课题研究的“茶碱体内清除率与CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4基因多态性的相关性”就是基于上述药物基因组学的理论。茶碱是临床常用的平喘药,应用已有80多年的历史,平喘作用快,能迅速改善呼吸道痉挛状况。近年来的研究表明,低浓度茶碱(5-10 mg/L)有抗炎和调节免疫的作用。因此,茶碱类药物是慢性阻塞性肺气肿(COPD)及哮喘防治指南的推荐用药,在我国有些地区仍是治疗哮喘的主要治疗药物。但是茶碱的治疗窗比较窄,治疗浓度和中毒浓度接近,血药浓度的有效浓度范围是5-20mg/L,而高于20 mg/L时即易发生不良反应。而且茶碱类药物有很多常见的不良反应,如心率失常、心肌缺血、失眠、谵妄、癫痫等,严重可导致死亡。因而茶碱的临床应用必须在血药浓度监测下合理应用,才能保证给药的安全性和有效性,国内外都将其列为主要监测药物之一。茶碱在体内90%代谢成为1,3-二甲基尿酸、1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤。1-甲基黄嘌呤不稳定,进一步代谢成为1-甲基尿酸,其余10%由原型从肾脏排泄。由于肝细胞色素P450酶1A2 (CYP1A2)对茶碱具有高亲和力,低浓度茶碱在体内的代谢过程主要由CYP1A2介导。细胞色素P450酶2E1(CYP2E1)对茶碱具有低亲和力和高容量,因此在高浓度时主要由CYP2E1介导。细胞色素P450酶3A4 (CYP3A4)也参与了茶碱体内的代谢,但是,由于CYP3A4对茶碱具有低亲和力和低容量,因此对茶碱代谢的影响较小。细胞色素P450酶是具有氧化功能的亚铁血红素蛋白酶家族,参与许多内、外源化合物的代谢。细胞色素P450酶亚家族种类很多,人体内肝脏细胞色素P450酶亚家族主要有CYP1、CYP2、CYP3家族。细胞色素P450酶活性在不同个体问存在很大的差异,与遗传、环境等因素相关,其中遗传因素起了非常大的作用。CYP1A2酶占肝脏P450酶(CYP450)重量的13%-15%,是肝脏代谢酶重要的组成成员。CYP1A2基因表达存在着很大的个体差异,文献报道在mRNA水平的表达大概存在着15-40倍的个体差异。目前已经报道的和CYP1A2活性及诱导性相关的单核酸位点有4个：G-3860A (CYP1A2*1C)、-2467delT(CYP1A2*1D)、C-1291(CYP1A2*1E)和C-164A (CYP1A2*1F)。 CYP2E1在肝脏代谢酶中所占比例不大,7%左右,但是介导很多内源性与外源性毒性物质的代谢。大部分底物具有分子量相对较低(<100)及亲脂性较高的特点。CYP2E1是酒精、解热镇痛药对乙酰氨基酚、抗结核药物等产生肝脏毒性的关键代谢酶。此外,CYP2E1被认为是各种有毒物质包括亚硝胺,苯,氯乙烯代谢活化的关键酶。CYP2E1基因序列相对保守,目前报道的多态性位点有10来个,其中有4个位点在亚洲人群报道具有功能活性：G1132A(CYP2E1*2)、 G10023A(CYP2E1*3)、G 4768A(CYP2E1*4)、G-1293C/C-1053T(CYP2E1*5B)。 CYP3A4是人体肝脏中含量最丰富的代谢酶,介导50%以上的药物的代谢。CYP3A4遗传序列也相对保守,目前仅仅发现几个位点的多态性可能影响酶活性。在亚裔人群中发现有功能活性的位点主要有以下几个：A13871G(CYP3A4*4)、C15702G (CYP3A4*5)、7661del (CYP3A4*6)、T 20070C (CYP3A4*18A)、C23237T (CYP3A4*19)及C15389T (CYP3A4*22)。上述三个代谢酶的基因多态性对茶碱体内代谢的影响的文献报道较少,且结论存在争议。有文献报道G-3860A (CYP1A2*1C)、C-164A (CYP1A2*1F)可能影响茶碱体内代谢,但是也有文献报道CYP1A2基因多态性对茶碱体内代谢没有影响。而关于CYP2E1对茶碱体内代谢的影响,仅有韩国学者发现CYP2E1-1566T>A,-1295 G>C,-1055 C>T,-1027 T>C及-807T>C这5个位点连锁的基因型茶碱体内清除减慢。CYP3A4基因多态性对茶碱体内代谢的影响,尚未见文献报道。因此,上述三个代谢酶的基因多态性是否对茶碱体内代谢有影响仍然没有定论。我们的前期工作分析了426名健康中国人CYP1A2酶活性与其功能位点的关系,发掘了5个单倍型标签SNP,构建了15条纯合子及突变频率大于3%的杂合子的单倍体。考察了这5个位点SNP及15条单倍体对CYP1A2酶活性的影响,发现CYP1A2新的突变位点G-3113A影响CYP1A2酶活性,G→A的突变酶活性降低,CYP1A2*1B与CYP1A2*1C野生纯合子CYP1A2酶活性略降低,而T3594G和CYP1A2*1F不同基因型间CYP1A2的活性无显著差异。单倍型之间CYP1A2酶活性也存在较大的差异,携带-3113A/A位点单倍型对表现为低酶活性,携带-3113G/G位点单倍型对表现为高酶活性。在这个研究基础上,我们进一步研究了37个健康中国人4个功能性位点突变纯合子对茶碱体内代谢的影响,发现4个位点突变纯合子之间茶碱体内代谢无差异。由于-3113A/A位点我们仅筛选到3例,受样本量影响,统计分析-3113位点对茶碱没有影响,但是3例-3113A/A位点茶碱血药浓度升高。因此,我们的前期研究发现CYP1A2 G-3113A位点突变可能导致CYP1A2酶活性降低,由于受样本量的影响,未发现CYP1A2 G-3113A对茶碱体内代谢影响具有统计学意义,因此茶碱体内代谢的个体差异的机制仍然不是很清楚。本研究试图从CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4三个代谢酶功能位点的突变,分析对茶碱体内清除率的影响,以明确影响茶碱体内代谢个体差异的遗传机制。研究的方法筛选了2013年9月一2014年7月符合入组条件的门诊患者111例,脱落10例,最终入组101例,其中男性受试者63例,女性38例,其中吸烟者18例,不吸烟者83例。101例受试者采集空白血样后,口服茶碱100 mg,2/日。2周后复诊,空腹不服药后采集外周血样2 ml于EDTA抗凝管,-80℃低温冰箱冻存。试验前征得南方医科大学珠江医院伦理委员会同意,签署知情同意书。试验在美国临床试验网(ClinicalTrials.gov)注册,并获得了注册编号(NCT02001935)。茶碱及其代谢产物(1,3-二甲基尿酸)的测定采用高效液相色谱法(HPLC)的方法。茶碱清除率用1,3-二甲基尿酸/茶碱(1,3-DU/TP)比值来计算。应用酚-氯仿法提取外周血白细胞中的DNA,进行PCR产物扩增后基因测序仪直接测序。CYP1A2基因检测了5个位点,CYP1A2 G-3860A (CYP1A2*1C)、C-164A (CYP1A2*1F)、C5347T (CYP1A2*1B)、G-3113A是我们前期研究发现在中国人群中存在多态性的位点,G-3533A (CYP1A2*7)在白种人中报道有功能活性的位点,此次也纳入检测范围。CYP2E1检测了4个在亚裔人群中报道有功能活性的4个位点：G1132A (CYP2E1*2)、G10023A (CYP2E1*3)、G 4768A (CYP2E1*4)、G-1293C/C-1053T(CYP2E1*5B)。CYP3A4检测了5个在亚裔人群中报道具有多态性的位点：A13871G (CYP3A4*4)、C15702G (CYP3A4*5)、 17661del (CYP3A4*6)、T 20070C (CYP3A4*18A)、C 23237T (CYP3A4*19)。对检测出有多态性的位点进行了单倍体的构建,进一步统计分析单个核苷酸位点多态性(SNP)及单倍型对茶碱体内清除率的影响。统计方法所有数据用mean±SD表示,按照不同基因型对受试者分组。单个SNP位点不同基因型间茶碱清除率的比较采用单因素方差分析的方法(One-way Analysis of Variation, one-way ANOVA)。不同性别间及两种基因型之间茶碱清除率的比较采用独立样本双侧t检验方法。P<0.05被认为具有统计学上的显著意义。所有统计采用SPSS 13.0软件。研究结果1.101患者中有1例样本检测数据缺失,计算了100例样本茶碱的药物浓度及茶碱清除率。100例患者口服茶碱100 mg,2/日后平均稳态浓度为3.52±1.45mg/L (mean±SD),最高浓度：8.31 mg/L,最低：1.13 mg/L。平均茶碱清除率(1,3-DU/TP) 0.058±0.033,最高清除率：0.259,最低清除率：0.041。茶碱体内清除率存在着较大的个体差异。2.101例受试者CYP1A2 G-3860A(CYP1A2*1C)突变频率为30.7%、C-164A (CYP1A2*1F)突变频率为30.0%、C5347T (CYP1A2*1B)突变频率为15.8%、G-3113A突变频率为9.9%。这几个位点的突变频率与我们之前研究的结果非常一致,而与白种人群的突变频率相差较大。而G-3533A (CYP1A2*7)在白种人中报道存在多态性,我们这次研究没有发现该位点存在突变。进一步分析4个具有多态性的位点不同基因型茶碱清除率之间的差异发现,CYP1A2 G-3860A、 C-164A、C5347T不同基因型之间茶碱清除率没有差异(P>0.05)。G-3113A突变纯合子AA型只有2例,合并到突变杂合子GA组,与野生型GG组比较,茶碱清除率有差异(P=0.016),-3113位点G→A茶碱清除率降低。3. CYP2E1 G1132A (CYP2E1*2)突变频率为0.5%,与文献报道的亚裔人群突变频率1.2%稍有差异。G 10023A(CYP2E1*3)、G 4768A (CYP2E1*4)本次研究未筛查到具有突变。G-1293C/C1053T(CYP2E1*5B)突变频率为18.8%,与文献报道的亚裔人群中的突变频率19-27%接近,但是与白种人中报道的突变频率0.8-1.0%,相差较大。进一步分析CYP2E1*5B不同基因型之间茶碱清除率之间的差异发现,CYP2E1*5B不同基因型之间茶碱清除率没有差异(P=0.731)。4. CYP3A4检测了5个位点突变频率较低。筛查到A13871G (CYP3A4*4)突变杂合子仅1例,突变频率0.5%,T20070C (CYP3A4*18A)突变杂合子4例,突变频率为2%。其他3个位点C15702G (CYP3A4*5)、7661de1 (CYP3A4*6)、 C23237T(CYP3A4*19)没有筛查到突变。进一步分析T20070C (CYP3A4*18A)野生型纯合子与杂合子之间茶碱清除率的差异,没有发现CYP3A4*18A位点突变对茶碱清除率有影响。5.对具有多态性的CYP1A2的4个位点的SNP进行单倍型构建,共构建了15条单倍型基因型。对单倍型对进行进一步的茶碱清除率分析发现,单倍型对-3113G/G-164A/A-3860G/G-5347T/C与其他单倍型比较茶碱清除率增加,而其他单倍型茶碱清除率无差异。结论1.本研究发现,茶碱100 mg,2/日的给药剂量,2周后体内平均稳态药物浓度为3.52 mg/L,达不到茶碱常用的平喘浓度(10-20mg/L),<10 mg/L的茶碱浓度能起到一个免疫调节和增强激素敏感性的作用,建议小剂量茶碱与激素合用,以达到茶碱增强激素敏感性的作用。2.本次研究考察了CYP1A2、CYP2E1与CYP3A4的14个位点,CYP1A2的4个位点与CYP2E1的1个位点突变频率较高,即CYP1A2 G-3860A (CYP1A2*1C)、C-164A (CYP1A2*1VF)、C5347T (CYP1A2*1B)、CYP1A2 G-3113A、G-1293C/C1053T(CYP2E1*5B)突变频率较高,与文献报道的亚裔人群的突变频率接近,但是与白种人群的突变频率相差较大。而其他的几个位点突变频率较低或者是没有突变,与文献报道的突变频率稍有差异。因此本次研究也证实了CYP1A2、CYP2E1与CYP3A基因多态性存在着种族差异。3.分析突变频率较高的几个SNP不同基因型茶碱清除率的差异后仅发现CYP1A2 G-3113A位点茶碱体内清除率降低,未发现其他位点突变对茶碱体内清除率有影响。这是本次研究首次发现CYP1A2 G-3113A影响茶碱体内代谢,因为CYP1A2 G-3113A位点突变频率中国人群比白种人群高,或许可以在一定程度上解释中国人群茶碱体内代谢比白种人群要慢的原因。4.通过对不同的单倍型对基因型茶碱体内清除率的比较发现,-3113G/G-164A/A-3860 G/G-5347T/C单倍型对基因型茶碱体内清除率增加。因此考察基因多态性对茶碱体内代谢的影响,还需考虑单倍型对的影响。