慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是以持续气流受限为特征的进行性炎症加重疾病,目前居疾病死亡原因第三位。COPD的急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)是导致COPD患者死亡的主要原因,具体临床症状表现为脓样痰液增加、呼吸困难、咳嗽及喘息等。呼吸道感染能够引起AECOPD的发生,主要包括病毒和细菌感染,其中细菌感染占AECOPD发病原因的50%左右。从AECOPD患者下呼吸道分离出的细菌包括不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable haemophilus infuenza,NTHi)、卡他莫拉菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌等,其中NTHi是COPD患者痰液中最常见的细菌。因此,明确NTHi诱导AECOPD的发生机制有助于深入了解疾病进程并进行有效干预。中性粒细胞是机体抵抗外源性感染的重要防线,在趋化因子的募集作用下能够迅速迁移至感染部位发挥吞噬作用。但过量的中性粒细胞聚集会导致中性粒细胞弹性蛋白酶、金属蛋白酶以及氧化活性物质的过度分泌,进而引起局部组织损伤。中性粒细胞伪足的形成及细胞骨架肌动蛋白的重塑对细胞迁移发挥重要作用,这一过程受磷脂酰肌醇(PtdIns)3-激酶(phosphatidylinositol(PtdIns)3–kinases,PI3K)信号通路的主要调节。化学趋化剂(如N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸,fMLP)刺激后,中性粒细胞表面G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)被激活,Gβγ亚基解离并激活PI3K,磷酸化下游效应因子蛋白激酶B(protein kinase B,AKT),促进F-肌动蛋白(F-actin)极化聚集在细胞边缘伪足区域,进而参与中性粒细胞的迁移。中性粒细胞被认为是COPD患者气道中最常见的炎症细胞之一,气道中性粒细胞的增多与NTHi感染密切相关。临床上将外周血中性粒细胞绝对值>7.5×10~9/L定义为中性粒细胞增多症。NTHi通过感染内皮细胞,产生一系列的炎症因子和趋化因子(如(interleukin,IL)-1β、IL-8等),募集大量中性粒细胞迁移至气道,而气道中性粒细胞的过度迁移则会导致患者肺功能下降与气道功能障碍。因此,深入探讨中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD发生中的作用,抑制中性粒细胞迁移从而降低气道炎症是预防治疗AECOPD疾病的关键性科学问题。目前,AECOPD的临床治疗包括吸入性支气管扩张剂、皮质类固醇及抗生素等,但受机体不良反应及耐药性的限制,并不能有效控制疾病的发展,因此,迫切需要安全有效的新型AECOPD治疗药物。有研究显示,人参等植物源药物具有抗炎作用,且无明显副作用,其主要活性成分为人参皂苷。目前从人参中已鉴定出100余种单体,其中人参皂苷Rg3单体具有多种药理活性,如抗炎、抗肿瘤和抗疲劳等。近来研究发现人参皂苷Rg3具有治疗呼吸道疾病的作用,如:人参皂苷Rg3可以通过调节癌细胞岩藻糖基化以及p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核转录因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路,抑制上皮-间质转化和肺癌的侵袭;人参皂苷Rg3能够抑制NF-κB的活性并减少相应炎症细胞因子的分泌;人参皂苷Rg3通过调节PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路可减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱发的急性肺损伤。综上,本文的研究目的是基于NTHi诱导的AECOPD模型,探讨中性粒细胞在AECOPD发生中的作用,明确人参皂苷Rg3能否通过抑制中性粒细胞的迁移进而调节气道炎症,从而对AECOPD起到治疗作用,并基于超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)的代谢组学方法初步探讨人参皂苷Rg3对AECOPD小鼠内源性代谢物和相关代谢途径的作用机制。一、NTHi诱导小鼠AECOPD的发生方法:将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分为4组(n=16),正常对照(Normal Control,NC)组,不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)感染组,香烟烟雾(Cigarette Smoke,CS)组和联合作用(NTHi+CS)组。其中CS和NTHi+CS组应用14周香烟烟雾鼻部暴露法建立小鼠COPD模型,NC和NTHi组暴露于正常空气。于第14周末,NTHi和NTHi+CS组小鼠滴鼻接种NTHi,NC和CS组滴入等量生理盐水。24 h后将各组小鼠麻醉固定。肺功能仪检测小鼠肺功能损伤情况,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察小鼠肺组织结构变化,细胞迪夫染色法和流式细胞术分析小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中性粒细胞细胞及巨噬细胞数量和比例,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠BALF中炎症因子的含量。结果:与NC组相比,NTHi组小鼠第0.1秒用力呼气量/用力肺活量(forced expiratory volume in 100 ms/forced vital capacity,FEV0.1/FVC)下降,气道发生中性粒细胞浸润。CS组小鼠经14周香烟烟雾暴露后,体重显著下降,肺功能残气量(functional residual capacity,FRC)和气道阻力(airway resistance,RI)增加,FEV0.1/FVC和肺动态顺应性(dynamic compliance,Cydn)下降,肺组织结构损伤,平均肺泡截距增加,小鼠BALF中炎症细胞增多,IL-6和Keratinocyte–derived细胞因子(KC,同人源IL-8)表达增多。当NTHi接种烟雾暴露的小鼠后,上述症状加重,小鼠体重下降,Cydn显著低于CS组,RI和平均肺泡截距显著高于CS组,BALF里中性粒细胞及巨噬细胞数量增多,IL-6和KC分泌升高,且差异具有统计学意义。二、中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD中的作用方法:首先将分离纯化的中性粒细胞与人支气管上皮细胞(BEAS-2B)培养,建立中性粒细胞跨气道上皮细胞迁移模型,分为NC组,NTHi组,CS组和NTHi+CS组,依次用NTHi和香烟烟雾刺激BEAS-2B细胞。ELISA法检测细胞上清液中IL-6和IL-8的含量。迪夫染色法观察中性粒细胞的迁移数量和形态。随后NTHi及香烟烟雾直接刺激中性粒细胞,分为NC组、NTHi组、CS组和NTHi+CS组,ELISA法检测中性粒细胞脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PtdIns(4,5)P2,PIP2)和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PtdIns(3,4,5)P3,PIP3)的含量,Western blot法检测PI3K信号通路相关蛋白的表达水平,免疫荧光法检测中性粒细胞内F-actin的蛋白分布和表达。结果:与NC组相比,NTHi和香烟烟雾刺激气道上皮细胞后,NTHi组和CS组上清液中炎性细胞因子IL-6和IL-8的含量显著升高,中性粒细胞跨上皮细胞迁移数量增多,且NTHi+CS组IL-6和IL-8的表达及中性粒细胞迁移数量显著高于CS组。NTHi和香烟烟雾刺激中性粒细胞后,与NC组相比,模型组中性粒细胞PI3K信号通路被激活,相关信号分子表达显著变化,PIP3及AKT蛋白磷酸化水平显著增加,F-actin蛋白发生极化表达,且NTHi+CS组变化最为显著。三、人参皂苷Rg3对AECOPD以中性粒细胞增多为特征的炎症反应的预防治疗作用1.人参皂苷Rg3对NTHi诱导的AECOPD模型小鼠的影响方法:将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分为9组(n=16):NC组,CS组,低、中、高浓度Rg3干预CS(CS+10 mg/kg Rg3、CS+20 mg/kg Rg3和CS+40mg/kg Rg3)组,NTHi+CS组,低、中、高浓度Rg3干预NTHi+CS(NTHi+CS+10mg/kg Rg3、NTHi+CS+20 mg/kg Rg3和NTHi+CS+40 mg/kg Rg3)组。应用14周香烟烟雾鼻部暴露法建立小鼠COPD模型,于第12周开始,每天进行人参皂苷Rg3灌胃给药治疗,于第14周末进行NTHi滴鼻接种。应用小动物肺功能仪检测各组小鼠肺功能指标,HE染色观察肺组织结构变化,流式细胞术分析BALF中中性粒细胞比例,ELISA法检测小鼠BALF中炎性因子IL-6和KC的含量。结果:与模型组相比,高浓度Rg3可显著增加模型组小鼠体重,中、高浓度Rg3可改善CS组和NTHi+CS组的各项肺功能指标,减少肺部病理损伤,降低小鼠BALF中炎症细胞的浸润,中性粒细胞比例以及IL-6、IL-8的含量,结果与CS组和NTHi+CS组相比具有统计学差异。2.人参皂苷Rg3对中性粒细胞迁移的抑制作用及机制研究方法:人参皂苷Rg3作用于人外周血分离纯化的中性粒细胞,将细胞分为6组:NC组,fMLP阳性对照(fMLP)组,Rg3低、中、高浓度药物(fMLP+Rg3(10μM)、fMLP+Rg3(20μM)、fMLP+Rg3(40μM))组和抑制剂(LY294002)组。在中性粒细胞跨上皮细胞(BEAS-2B)迁移模型的基础上,检测各浓度药物对中性粒细胞迁移数量的影响。将fMLP、人参皂苷Rg3以及LY294002分别先后作用于各组中性粒细胞,ELISA法检测细胞脂质PIP2和PIP3的含量,Western blot法检测PI3K信号通路相关蛋白的表达水平,免疫荧光法检测中性粒细胞内F-actin的蛋白分布及表达水平。结果:与未加药物空白对照组相比,各浓度药物组中性粒细胞跨上皮细胞迁移的数量均显著减少。将fMLP、人参皂苷Rg3以及LY294002分别作用于各组中性粒细胞后发现,与NC组相比,fMLP组PI3K通路相关信号分子PIP2的含量显著降低,PIP3的含量显著增高,PI3K及AKT蛋白磷酸化水平显著增加,F-actin蛋白极化表达。与fMLP组相比,各浓度Rg3组均在一定程度上抑制了PI3K相关信号分子表达,其中40μM Rg3组PIP3的含量显著降低,PI3K及AKT蛋白磷酸化水平显著降低,F-actin蛋白极化表达降低,均匀分布于整个细胞质,结果与LY294002组结果相似。3.人参皂苷Rg3对AECOPD模型小鼠的代谢组学影响的研究方法:收集上述NC组,NTHi+CS组和NTHi+CS+40 mg/kg Rg3组小鼠尿液,并命名为NC组,AECOPD组和Rg3组(n=6)。应用UPLC-QTOF-MS对样本进行检测,应用MassLynx V4.1工作站进行数据采集分析。结果:与NC组相比,AECOPD模型组小鼠尿液中许多内源性代谢物含量发生了明显改变,人参皂苷Rg3干预可显著回调L-色氨酸、花生四烯酸、亚油酸、白细胞三烯A4、核黄素和皮质醇等19种内源性代谢物水平,推测人参皂苷Rg3通过干预亚油酸代谢、核黄素代谢、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成和鞘脂代谢等6条代谢途径而发挥对AECOPD的保护作用。结论:1.NTHi感染联合香烟烟雾刺激建立的AECOPD模型,特点为中性粒细胞迁移引起的以中性粒细胞浸润为主的气道炎症。2.AECOPD发生的可能机制为AKT磷酸化引起的PI3K相关分子信号通路激活,引起中性粒细胞迁移。3.人参皂苷Rg3通过抑制中性粒细胞内PI3K信号通路的活化,从而抑制中性粒细胞迁移,减少炎症的发生,对AECOPD发生具有一定程度的预防作用。4.人参皂苷Rg3对AECOPD发生的预防作用,与其调节亚油酸代谢、核黄素代谢、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成和鞘脂代谢等6条代谢途径有关。创新性:1.本文发现了PI3K信号通路的激活是NTHi感染联合烟雾刺激引起AECOPD中性粒细胞迁移浸润增多的主要机制,提示PI3K可能是AECOPD的治疗靶点之一。2.本文发现了人参皂苷Rg3能够通过抑制中性粒细胞PI3K信号通路的激活,从而减轻AECOPD中性粒细胞增多引起的炎症反应,提示人参皂苷Rg3具有开发为防治AECOPD药物的潜力。