热处理是食品加工必要的环节,能引发食物组分在物理、化学上的变化,从而影响着食品的性质与功能。作为食品中的主要成分,各类生物大分子(如蛋白质、糖和脂类)在热处理过程中表现出迁移、降解、组合等行为,最终不仅在化学反应上呈现了新的化合物,而且在物理上呈现出新的构造。对食品和中药在热处理过程中的研究多集中于成分的化学变化,如活性成分的稳定性、检测方法建立和生成机制等。食品和中药在热处理后存在纳米构造是广为人知的现象,但对于生物大分子在热处理过程中“如何自组装形成微纳米结构”,“该纳米结构的存在具有何种生物学效应”等问题却少有研究涉及。已有研究显示,食品和中药的生物大分子在热处理过程中能发生热诱导自组装行为形成纳米级微粒,在形成纳米微粒后获得了抗氧化性等新的生物学活性,或能装载具有生物学活性的小分子。通过前期工作,本课题提出“食品热处理过程中生物大分子自组装形成的纳米结构对食品的生物学功效具有重要贡献”,围绕这个科学假说,课题研究以“药食同源”的苦杏仁作为研究对象,调查了苦杏仁蛋白组分在热处理过程的自组装现象,并对获得的蛋白纳米微粒进行性质表征与应用研究。课题通过色谱分离、蛋白质鉴定方法,从中国苦杏仁中纯化获得类似11S球蛋白的组分,该球蛋白由六个单体(A-pro)聚合形成,每个单体分别由一个酸性亚基与一个碱性亚基通过二硫键连接而成。在对其进行热处理的过程中,发现该蛋白组分发生了包含解折叠、亚基重排、自组装等一系列变化,从而开启对苦杏仁11S球蛋白自组装行为的性质与应用研究,主要研究结果如下:(1)苦杏仁蛋白单体A-pro热处理过程发生链内二硫键断裂,为保持结构稳定,二硫键残端发生重新排列形成二硫键连接产物,该过程主要发生在酸性亚基AS-1与AS-2(42-44 kDa)之间,因此在热处理过程中观察到新出现的蛋白质组分的分子量约为88 kDa。伴随二硫键连接物的形成,同期观察到纳米级构造的形成,表明纳米微粒的自组装行为与二硫键密切相关。通过对自组装行为的研究,发现A-pro自组装行为发生的温度条件必须高于A-pro的相变温度76℃,加热导致A-pro的二级结构被破坏,α-螺旋含量急剧减少,蛋白质的疏水片段暴露于分子表面,此时A-pro依靠二硫键、氢键维持特定的空间结构,位于分子表面的疏水基团通过疏水作用形成大小均匀的纳米微粒,并将二硫键、氢键包裹于结构内部,因此A-pro在热处理过程的自组装行为主要以二硫键、氢键为基础。(2)蛋白质自组装行为的本质是分子之间的相互作用,通过对包括pH、温度在内的化学因素的调节,对自组装行为的影响,进而对纳米微粒的大小与形态实现调控。研究发现,酸性环境使苦杏仁蛋白溶解度下降而发生沉淀,碱性环境利于蛋白质发生自组装行为;低浓度钠盐促进自组装行为发生,而高浓度钙盐导致体系出现沉淀;蛋白质浓度越低,自组装发生的速率越慢;温度越高,形成稳定纳米微粒的粒径越大。(3)依据化学因素对自组装行为的调控机制,本课题筛选出A-pro形成纳米微粒的最适条件:pH 9.0、加热温度95℃、热诱导时间10 min、蛋白浓度1 mg/mL,形成的纳米微粒命名为Apro-NPs,其直径约90nm,呈单一分散系,分布均匀。Apro-NPs具备良好的温度响应规律,呈现升温聚合,降温分解的趋势。此外,该纳米微粒具备良好的低温稳定性,利于低温环境下的保存。(4)食物来源的蛋白质通过自组装形成纳米微粒,其安全性高于人工合成的纳米材料,因此在制备纳米载体方面具备良好优势。对细胞安全性评价结果显示,Apro-NPs比提高了正常细胞的存活率,获得了比蛋白质更高的安全性;包封试验结果显示,Apro-NPs成功装载了抗癌药物苦杏仁甙与紫杉醇,由于Apro-NPs是通过微粒形成过程将紫杉醇包藏在分子内部实现装载,该方式比苦杏仁甙的表面结合形式更加紧密,因此对紫杉醇的装载效率远高于苦杏仁甙,同时也导致对紫杉醇的缓释效果优于苦杏仁甙;此外,经Apro-NPs装载的药物不同程度提高了对癌细胞增殖的抑制效果,最大提高率可达43%,为蛋白质载体实现靶向递送的研究奠定了基础。