临床上,急性肾功能衰竭(Acute renal failure,ARF)的发生率居高不下,美国成人ARF年发生率为0.02%,普通病房ARF发生率为5%,而ICU病房ARF的发生率则高达30-50%,而且应激条件下,老年人群ARF的易感性更高。ARF不仅严重危及人类生命和生活质量,而且给社会带来沉重的经济负担。肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia–reperfusion injury,IRI)是自体肾发生ARF的主要原因,而在移植肾无一例外的要发生ARF。IRI急性期主要的病理改变是肾小管损害,表现为肾小管坏死和肾小管上皮细胞凋亡,这种损害不仅是肾脏急性功能障碍的病理基础,而且还对肾脏结构和功能的改变产生长期效应(Long-term effects),其中IRI后的氧化应激等因素,可造成细胞DNA损伤并激活细胞衰老信号通路,引起细胞衰老。推测一方面,IRI诱导和加速肾小管上皮细胞衰老可能是产生这种长期效应的重要原因之一;另一方面,自然衰老的肾小管上皮细胞在IRI作用下可能更易走向死亡(坏死和凋亡),成为老年人群ARF易感性增高的重要原因。由于p53是重要的细胞周期调节蛋白之一,细胞在p53的影响下是选择死亡还是分裂阻滞(衰老),可能与p53的表达水平、细胞所处的周围环境以及不同的p53靶基因激活有关。本研究旨在探讨肾脏IRI后,肾小管上皮细胞的急性和慢性演变特征、以及p53对这种演变的调控作用和相关机制,为ARF和衰老相关性肾脏疾病的防治提供理论依据。本课题研究包括以下四个部分:第一部分缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞的演变及其意义1.目的:观察肾脏缺血再灌注损伤(IRI)后正常和衰老肾小管上皮细胞的演变,探讨细胞衰老在衰老相关性肾脏病理变化中的作用。2.方法:以低龄(2m龄)和高龄(12m龄)野生鼠为研究对象,建立左肾IRI模型。于IRI后0d、1d、3d、7d、1m、3m、6m,用HE染色观察肾小管组织学变化,免疫荧光法检测肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,组织化学染色观察肾小管上皮细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活性,TUNEL法检测凋亡肾小管上皮细胞。3.结果:肾脏IRI后0d,肾小管以坏死为主,高龄鼠比低龄鼠更为明显(P<0.05)。IRI 1d后出现肾小管上皮细胞凋亡,7d时凋亡达到高峰(P<0.05),且在同一时间点,高龄鼠比低龄鼠严重(P<0.05)。低龄鼠IRI肾1m时出现肾小管上皮细胞衰老,而对侧肾没有出现,3m、6m点衰老细胞显著增多(P<0.05);高龄鼠IRI后0 d双肾均可见大量衰老的肾小管上皮细胞,但IRI肾的衰老细胞在IRI 1d后明显减少(P<0.05),1m后又逐渐增多,只是仍较对侧肾脏少,但却较同时间点低龄鼠肾脏多,6m后高龄鼠双肾衰老的肾小管上皮细胞几乎又达到同一水平。PCNA阳性染色细胞出现的几率两组相比没有统计学差别(P>0.05),但低龄组细胞增殖能力要强于高龄组。对高龄鼠IRI后1d点肾小管上皮细胞凋亡与衰老之间的相关分析显示,二者存在显著负相关(r=-0.82, P<0.001)。4.结论:①IRI可促进正常肾小管上皮细胞衰老的进程;②已经进入衰老状态的肾小管上皮细胞在遭受IRI刺激后,更易走向死亡(坏死和/或凋亡)。肾小管上皮细胞的这种演变,在老化相关性肾脏病理变化发生和进展中可能发挥着重要作用。第二部分p21对缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞演变的影响1.目的:探讨p21对缺血再灌注损伤(IRI)后肾小管上皮细胞演变的影响。2.方法:选择低龄(2月龄)和高龄(12月龄)p21(+/+)和p21(-/-)鼠,建立左肾IRI模型。于IRI后0、1、3、7d及1、3、6月光镜下观察肾小管组织学变化,采用免疫荧光法检测肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达,组织化学染色观察肾小管上皮细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活力,末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺口末端标记技术(TUNEL)检测肾小管上皮细胞凋亡。3.结果:IRI后0d,肾小管以坏死为主,高龄鼠比低龄鼠严重、p21(-/-)鼠比p21(+/+)严重(P<0.05)。肾小管上皮细胞凋亡在1d后出现,7d时达到高峰,且高龄鼠比低龄鼠明显、p21(-/-)鼠比p21(+/+)鼠明显(P<0.05)。低龄鼠IRI后1月出现SA-β-Gal染色阳性的肾小管上皮细胞,而对侧肾此时未见衰老细胞,3、6月时衰老的肾小管上皮细胞显著增多、且p21(+/+)鼠比p21(-/-)鼠明显(P<0.05);p21(+/+)高龄鼠IRI后0d双肾即可见大量的SA-β-Gal染色阳性肾小管上皮细胞、且显著重于p21(-/-)鼠(P<0.05),但1d后,p21(+/+)和p21(-/-)鼠IRI肾衰老细胞明显减少(P<0.05),1月后又呈进行性增加,且p21(+/+)始终比p21(-/-)鼠严重。高龄和低龄p21(+/+)鼠PCNA阳性染色细胞出现的几率差异无统计学意义(P>0.05),但低龄鼠细胞增殖能力要强于高龄鼠;而p21(-/-)鼠的细胞增殖能力明显强于p21(+/+)鼠、低龄鼠更为显著(P<0.05)。对高龄鼠IRI后1d点细胞衰老和凋亡进行相关分析显示,二者呈显著负相关[p21(+/+)鼠r=-0.82, P<0.001;p21(-/-)鼠r=-0.76,P<0.001]。4.结论:p21在IRI所致肾小管上皮细胞演变过程中发挥着重要的调控作用。第三部分P53对缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞演变的影响1.目的:观察缺血再灌注损伤(IRI)后,低龄和高龄p53(+/+)和p53(-/-)鼠肾小管上皮细胞的演变,探讨P53基因对IRI后肾小管上皮细胞演变的影响。2.方法:分别建立低龄(2月龄)和高龄(12月龄)p53(+/+)和P53(-/-)鼠左肾IRI模型。于IRI后0d、1d、3d、7d、1月、3月、6月,用HE染色观察肾小管组织学变化,免疫荧光法检测肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen ,PCNA)的表达,组织化学染色观察肾小管上皮细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活性,用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin in situ nick-end labeling,TUNEL)法检测肾小管上皮细胞凋亡。3.结果:IRI后0d,肾小管以坏死为主,高龄鼠比低龄鼠明显(P<0.05),p53(-/-)鼠比p53(+/+)鼠明显(P<0.05);细胞凋亡在7d时达到高峰,且高龄鼠比低龄鼠明显(P<0.05),p53(+/+)鼠比p53(-/-)鼠明显(P<0.05)。p53(+/+)低龄鼠IRI后1月出现衰老细胞,3月和6月显著增多(P<0.05),对侧肾未见衰老细胞;而p53(-/-)低龄鼠IRI后6月才出现明显的衰老细胞;两种基因型高龄鼠在IRI后0d双肾均见衰老细胞,但p53(+/+)鼠显著多于p53(-/-)鼠(P<0.05),1d后,IRI肾的衰老细胞明显减少(P<0.05),对侧肾无变化。p53(+/+)高龄和低龄鼠细胞增殖没有统计学意义(P>0.05),而p53(-/-)低龄和高龄鼠在IRI后3、7d细胞增殖进行性增加,且低龄鼠显著多于高龄鼠、p53(-/-)鼠多于p53(+/+)鼠(P<0.05)。对高龄鼠IRI后1d点细胞衰老和凋亡进行相关分析显示,在p53(+/+)鼠二者显著负相关( r=0.82, P<0.05),在p53(-/-)鼠,二者无显著相关性(r=0.26,P>0.05)。4.结论:p53在IRI所致肾小管上皮细胞演变过程中发挥着重要的调控作用。第四部分p53-p21-Rb信号通路在缺血再灌注损伤诱导肾小管上皮细胞衰老中的作用1.目的:研究肾脏缺血再灌注损伤(IRI)后期肾小管上皮细胞的衰老演变以及p53、p21和Rb表达的变化,探讨p53-Rb信号通路在肾小管上皮细胞衰老中的作用。2.方法:建立p53(+/+)和p53(-/-)鼠单侧肾脏缺血再灌注损伤(IRI)模型,研究IRI后不同时间点肾小管组织形态学变化、肾小管上皮细胞的衰老变化以及p52、p21和Rb蛋白表达的变化。3.结果:p53(+/+)鼠肾脏在IRI后期,出现严重而广泛的慢性小管间质纤维化,肾小管上皮细胞衰老在IRI后3月和6月点显著增加(P<0.05);而在p53(+/+)鼠对侧肾和p53(-/-)鼠双肾,在IRI后1月和3月点几乎没有出现肾小管上皮细胞衰老;p53(-/-)鼠的IRI肾在IRI后6月点也只检测到少量衰老的肾小管上皮细胞。在两种基因型小鼠,细胞衰老与p53、p21和Rb蛋白的表达有相关性(P<0.05)。4.结论:IRI可以加速肾小管上皮细胞衰老,这可能是IRI“长期效应”的机制之一。P53-Rb信号通路的激活在IRI诱导肾小管上皮细胞衰老的发生中可能发挥着重要作用。