本研究的目的:是评估通过在脂质体介导下联合应用IL-1Ra和TGF-β1基因防止关节软骨退变的能力。我们假设联合应用抑制性细胞因子和促合成代谢因子能够防止软骨退变和促进软骨基质的合成。 第一部分重组人IL-1Ra和TGF-β1质粒的构建 目的：扩增、纯化重组人基因pEGFP-C1-IL-1Ra和pEGFP-C1-TGF-β1，并进行酶切鉴定，为基因转染提供目的基因。 方法：从人胎肝细胞中提取总RNA，RT-PCR法逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增IL-1Ra和TGF-β1目的基因片段，克隆进pGEM-T Easy Vector载体并测序。通过Bgl II和XhoI进行双酶切，酶切片断通过T4DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上，构建pEGFP-C1-IL-1Ra和pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒。制备DH5a感受态，进行质粒转化，铺板筛选并提取阳性克隆酶切鉴定。 结论：成功克隆和建立重组人pEGFP-C1-IL-1RαpEGFP-C1-TGF-β1真核表达质粒，为进一步OA基因治疗研究奠定了基础。 第二部分重组人IL-1Ra和TGF-β1基因转染软骨细胞后的表达 目的：探讨重组人IL-1Ra和TGF-β1双基因转染兔软骨细胞后的表达及对细胞生物学性状的影响，为OA基因治疗中目的基因的选择提供参考。 方法：无菌条件下取新西兰白兔髋膝关节软骨，经消化分离，软骨细胞以1.5×105／ml浓度培养于6孔培养板。软骨细胞分为4组，即转染IL-1Ra(4μg)组、转染TGF-β1(4μg)组、转染IL-1Ra(4μg)+TGF-βl(4μg)双基因组、未转染组。上述转染组均以Lipofectamine TM 2000 Reagent脂质体为转染媒介。通过倒置荧光显微镜观察转基因的表达和实时荧光定量PCR检测其表达，MTT法检测IL-1Ra和TGF-v1基因转染对软骨细胞生物学性状的影响。 结论：IL-1Ra和TGF-β1双基因转染软骨细胞可以获得表达，为OA的基因治疗提供研究基础。 第三部分转IL-1Ra和TGF-β1基因治疗兔骨性关节炎的体外实验 研究目的：观察重组人IL-1Ra和TGF-β1双基因在体外对兔OA软骨退变的治疗效果，为今后OA的基因治疗提供依据。 方法：取新西兰白兔关节软骨，经消化分离，软骨细胞以1.5×105／ml浓度培养于6孔培养板。软骨细胞分为5组，转染IL-1Ra组、转染TGF-β1组、转染IL-1Ra+TGF-β1双基因组、未转染组、空白组，转染方法同第二部分。上述转染组均以Lipofectamine TM 2000 Reagent脂质体为转染媒介。各组加入软骨块，除空白组外，其余各组均加入20ng IL-1β，通过倒置荧光显微镜观察转基因的表达。分别于2d、4d、6d后每组各取4孔1.5ml培养基，ELISA法检测TGF-β1和IL-1Ra的含量，RIA法检测IL-1β和TNF-α的含量。收集第6d软骨块HE染色、阿尔新蓝染色及II型胶原免疫组化检测等组织学观察。 结论：转基因组均对损伤软骨有修复作用。转染IL-1Ra+TGF-β1双基因组的治疗效果优于单基因。联合应用IL-1Ra和TGF-β1能抑制软骨的退变和促进软骨的修复，为体外OA的基因治疗提供良好的实验基础。 第四部分转IL-1Ra和TGF-β1基因治疗兔骨性关节炎的体内实验 研究目的：观察重组人IL-1Ra和TGF-β1双基因在兔体内对OA软骨退变的治疗效果，为今后OA的基因治疗提供依据。 方法：采用切断并切除内侧副韧带0.5cm及切除内侧半月板的方法，将16只新西兰白兔的双膝关节制成早期OA模型，术后第5d，分为4组向关节腔注射，A：空白对照组(NS 0.5ml)，B：IL-1Ra 100μg+脂质体50μl+NS 0.5ml，C：TGF-β100μg+脂质体50μl+NS 0.5ml，D：IL-1Ra100μg+TGF-β1100μg+脂质体100μl+NS 1ml。两天后再注射一次。注射后第7d用无菌NS灌沈关节腔，抽取关节灌洗液进行IL-1Ra、TGF-β1的EIASA分析以及IL-1β、TNF-α的RIA分析。注射治疗后第14d取关节标本Mankin's评分、HE染色、番红O染色及免疫组化检测。 结论：转基因组均对损伤软骨有修复作用。转染IL-1Ra和TGFβ1双基因组的治疗效果优于单基因。关节腔注射IL-1Ra和TGF-β1质粒能抑制软骨的退变和促进软骨的修复，为体内早期OA的基因治疗提供良好的实验基础。