小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus,PPRV)引起的小反刍动物(特别是山羊和绵羊)的烈性、接触性传染病。具有极高的发病率和死亡率。目前,世界各国都在广泛使用小反刍兽疫弱毒疫苗来预防该病,但无法从血清学上区分PPR疫苗株和野毒株感染,这就给接种过PPR疫苗的疫区在血清学调查上带来困难,影响了该病流行病学和相关研究的进行。为了解决传统弱毒疫苗的缺点,本研究构建山羊痘病毒通用载体并在此基础上构建了PPRV H基因重组山羊痘病毒,为重组山羊痘病毒和小反刍兽疫基因工程新型疫苗的研制打下初步基础。1.启动子P11和P7.5的有效性验证参照山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)基因序列,设计了包含GPV疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase )基因和背靠背启动子P11和P7.5的质粒PtkPP,在TK基因中间切开,链接上背靠背启动子P11和P7.5,两个启动子下游设计为多克隆位点。为了验证两个启动子的有效性,分别在两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别转染羊睾丸(Lamb testicle,LT)细胞,通过荧光显微镜可以观察到EGFP的表达,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,为后续工作打下基础。2.表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定在PtkPP启动子P11的下游插入gp(t黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,EGFP基因位于gpt基因的下游。该重组质粒转染感染GPV的LT细胞,同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。3.小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定依据GenBank上登陆的小反刍兽疫病毒全基因序列,设计合成了小反刍兽疫病毒H基因的引物,用PPRV的cDNA产物为模板,通过PCR克隆了PPRV H基因。把PPRV H基因克隆到已构建好的GPV通用载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组质粒PtkPgpt-egfpPpprv-H,并通过酶切鉴定重组质粒,大量制备重组质粒PtkPgpt-egfpPpprv-H。质粒PtkPgpt-egfpPpprv-H转染感染GPV的LT细胞后,通过同源重组获得重组PPRV H基因的山羊痘病毒,经过筛选,最后通过PCR鉴定,证明PPRV H基因插入到GPV基因中。