论文部分内容阅读
研究背景与目的2010年在美国,胰腺癌所导致的死亡,占总的癌症死亡率的第四位,我国的情况与美国相似。在过去的五年里,尽管在治疗策略上有所发展,但是治疗后一年生存期的患者不超过24%,并且治疗后5年生存期的患者低于5%。胰腺癌高死亡率的原因,主要是胰腺癌发病隐匿,难以被早期发现,其恶性程度较高,容易发生远处转移。吉西他滨(Gemcitabine, GEM)是一种嘧啶类似物,是晚期胰腺癌化疗常用的一线药物,但不能明显减少胰腺癌的死亡率。因此,开发能够增加胰腺癌治疗疗效、减少毒副反应和耐药性的新药或联合用药治疗方案称为目前最迫切的需要。佛波酯类化合物有多种生物学活性,12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)在较低浓度就对血液肿瘤细胞和多种实体瘤有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用。12-O-乙酰佛波醇-13-癸酰酯(12-O-acetylphorbol-13-decanoate, APD)没有PKC活性,对肿瘤细胞的作用研究尚不多见。本课题通过体外的方法观察佛波酯类化合物(TPA和APD)联合抗代谢类药物吉西他滨对胰腺癌细胞株Panc-1抑制增殖、诱导凋亡和侵袭能力改变方面的影响,初步探讨佛波酯类化合物对胰腺癌细胞的作用机制,并为抗胰腺癌新药的开发提供理论依据。同时,寻找新的能够提高胰腺癌疗效的药物联合治疗方案,为胰腺癌的治疗提供新的途径。研究方法1佛波酯类化合物联合GEM对胰腺癌Panc-1细胞的作用1.1细胞培养胰腺癌细胞株Panc-1用RPMI-1640培养基在37℃,5%CO2饱和湿度的无菌培养箱中常规培养,每3天传代1次。1.2 TPA或APD联合GEM的浓度效应关系及细胞形态学的观察MTT的方法检测药物单独及联合作用后细胞抑制率的变化,绘制量效曲线,并进行统计学分析。分别于各组培养24h、48h、72h、96h后观察细胞形态学的变化。1.3 TPA或APD联合GEM对Panc-1细胞周期分布的影响用PI染色,流式细胞仪检测细胞周期变化。1.4 TPA或APD联合GEM对Panc-1细胞凋亡的影响用Annexin V-FITC及PI双染的方法,流式细胞仪检测细胞凋亡。1.5 TPA或APD联合GEM对Panc-1细胞表面抗原CXCR4表达的影响用流式细胞仪检测细胞表面抗原CXCR4的表达变化。1.6 TPA或APD联合GEM对Panc-1细胞侵袭能力的影响采用Transwell的方法进行检测。2统计分析结果采用SPSS10.0统计软件进行数据分析,所有数据均用x±S表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间均值比较。P<0.05记为有统计学差异。结果1.1细胞形态学的变化TPA作用96h后,细胞聚集、折光率降低、体积变大、向周围伸出伪足,一部分细胞呈圆形,板底有细胞碎片出现。高浓度组,高倍镜观察发现胞内出现许多小空泡状细胞。APD作用96h后,细胞形态学变化与TPA相似。GEM作用96h后,表现为细胞伸展较大、折光率降低、周围伸出伪足多且不规则,板底出现许多细胞碎片,高倍镜下观察到明显的细胞破裂溶解,并呈时间和浓度依赖性,细胞周围明显伸展出伪足。TPA或APD联合GEM组,形态学变化均比单用组明显。1.2 TPA、APD、GEM单用的浓度效应关系TPA、APD、GEM单独作用Panc-1细胞96h后,TPA的IC50为1.43nmol·L-1,APD的IC50为22.91nmol·L-1, GEM的IC50为42.40nmol·L-1,均在较低的浓度就能够对Panc-1细胞产生较强的抑制增殖的作用。1.3 TPA或APD联合GEM对细胞增殖作用的影响TPA(0.32nmol·L-1、0.48nmol·L-1)与GEM合用时的IC50分别为17.38mno1·L-1、11.OOnmol·L-1; APD (3.56nmol·L-1、8.90nmol·L-1)与GEM合用时的IC50分别为20.60nmol·L-1、12.11nmol·L-1。TPA (0.32nmol·L-1、0.48nmol·L-1)和APD(3.56nmol·L-1、8.90nmol·L-1)均能够协同一定浓度范围内的GEM(6.68nmol·L-1～66.80nmol·L-1)对Panc-1细胞的抑制增殖作用,有统计学差异(P<0.01)。1.4 TPA或APD联合GEM对细胞周期分布的影响TPA、APD组作用相似,G0/G1期细胞相对比例有所下降,G2/M期比例增加；GEM作用组,则是G0/G1期细胞相对比例有所降低,细胞阻滞在S期。TPA0.32nmol·L-1或APD 3.56nmol·L-1与GEM 16.70nmol·L-1、33.40nmol·L-1联合组对细胞周期影响相似,Go/G1期细胞比例显著下降,S期、G2/M期比例增加,各用药物组与对照组之间,联合用药物组与单独用药物组之间有统计学差异(P<0.05)。1.5 TPA或APD联合GEM对Panc-1细胞凋亡的影响Annexin V-FITC/PI双标记法,流式细胞仪检测结果显示：TPA、APD、GEM单独应用,都能够诱导Panc-1细胞凋亡(P<0.01),具有浓度依赖性。TPA8-OOnmol·L-1、APD 35.60nmol·L-1、GEM 213.76nmol·L-1诱导细胞凋亡分别为39.05%、37.09%、58.08%。TPA 0.32nmol·L-1或APD 3.56nmol·L-1与GEM16.70nmol·L-1 33.40nmol`L-1联合组,能够显著诱导Panc-1细胞凋亡,分别为55.32%、65.01%或48.42%,64.43%。各用药物组与对照组之间,联合用药物组与单独用药物组之间有统计学差异(P<0.05)。1.6 TPA或APD联合GEM对Panc-1细胞表面抗原CXCR4表达的影响TPA、APD处理96h后,CXCR4的阳性表达率、荧光强度有不同程度的降低,与对照组相比有统计学差异,P<0.01,降低程度具有浓度依赖性。TPA8.00nmol·L-1和APD 35.6nmol·L-1对CXCR4的阳性表达率分别降低62.93%、45.85%。GEM单独作用或者与TPA、APD联合,CXCR4的阳性表达率、荧光强度与对照组相比无统计学差异。1.7 TPA或APD联合GEM对细胞侵袭能力作用的影响与对照组相比,TPA、APD处理后,Panc-1细胞的侵袭能力有不同程度的降低,差别有统计学差异,P<0.01。TPA8.00nmol·L-1、APD35.6nmol·L-1处理后Panc-1细胞的侵袭能力分别降低47.62%,42.41%。GEM单独作用或者与TPA、APD联合,Panc-1细胞的侵袭能力与对照组相比无统计学差异。结论1 TPA、APD、GEM对Panc-1细胞均有抑制增殖和诱导凋亡的作用；降低G0/G1期细胞比例。TPA、APD能够协同GEM对Panc-1细胞的增殖抑制和诱导凋亡,降低G0/G1期细胞比例。2 TPA、APD均能够降低Panc-1细胞表面抗原CXCR4的表达以及降低细胞的侵袭能力。3 TPA、APD对胰腺癌细胞Panc-1的抑制增殖作用可被PKC抑制剂GF109203X部分消除,可能有其他的非PKC佛波酯受体参与作用。