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研究背景与目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)已成为目前终末期肾病(End-stage renal disease, ESRD)的主要基础病之一,其主要病理改变为肾间质细胞外基质聚积最终导致肾间质纤维化。既往研究表明,肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation, TEMT)在其过程中发挥了重要作用。整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)是一种与整合素细胞内区域相结合的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在调节细胞粘附、迁移、基质积聚等过程中起重要作用,与肾脏疾病的发生发展密切相关。研究表明ILK是TGF-β1/Smad信号传导途径的重要下游效应分子,也是该信号传导途径诱导TEMT的关键步骤,参与ECM聚积过程。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)可降解包括IV型胶原在内的多种ECM成分。金属蛋白酶组织抑制齐(?)-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)作为MMP--9的抑制物可与其特异性结合,保持动态平衡。发生TEMT时,MMP-9表达增多,引起MMP-9/TIMP-1失衡。高表达的MMP-9可特异性过度降解小管基底膜的Ⅳ型胶原,破坏基底膜。转分化的肾小管上皮细胞随后穿过断裂的基底膜,到达肾间质成为MyoF,促进间质纤维化的进一步发展。MMP-9/TIMP-1失衡可能是TEMT过程中的促进因素。大黄酸(rhein)作为大黄的主要有效成分,已被证实对肾脏有保护作用。本课题组通过前期研究发现,大黄酸可以抑制糖尿病肾病TEMT的发生,但其作用是否与调节ILK表达及影响MMP-9/TIMP-1比值,抑制TEMT及纤维化的进展有关?尚不清楚。本研究拟从糖尿病肾病患者、糖尿病肾病大鼠、与体外高糖环境下人肾小管上皮细胞培养三个研究层面入手,观察在DN小管间质病变中,肾小管上皮细胞转分化与ILK、MMP-9/TIMP-1表达的改变,同时采用ILK小分子干扰RNA技术(siRNA)特异性抑制ILK的表达,进而探讨ILK对MMP-9/TIMP-1的调控机制及其在TEMT中的作用；同时用大黄酸干预处理,观察大黄酸对DN的治疗作用及其对上述过程的影响,旨在从TEMT的角度探讨DN发病的具体机制及中药大黄防治DN的可能新靶点。方法：1.收集糖尿病肾病患者肾穿刺活检标本,使用HE染色、PASM染色及Masson染色方法,了解其肾脏损伤程度；免疫组织化学方法检测肾组织中E-cadherin、α-SMA的表达水平,并与正常肾组织比较,以观察人糖尿病肾病发病过程中是否存在TEMT。2.饲养8周龄健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常组(12只),糖尿病组(12只)、大黄酸组(12只)及缬沙坦组(12只)。分别于第8、16周末,每组各处死6只大鼠,肾脏原位灌洗后,取肾组织,固定于蜡块中并切片。HE染色检测肾小管间质损伤程度,Masson染色方法观察肾间质胶原相对面积,免疫组织化学方法检测E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、ILK、MMP-9、TIMP-1及AP-1的表达水平。3.培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2),并分为：正常对照组、高糖组、高糖+抑制ILK表达组、高糖+无序siRNA组、高糖+大黄酸低浓度干预组、高糖+大黄酸中浓度干预组、高糖+大黄酸高浓度干预组、高渗对照组。各组细胞培养48小时后,分别提取细胞总RNA、总蛋白,使用Real-time RT PCR法、Western blot法及细胞免疫组织化学染色法评定各组细胞E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、 ILK、MMP-9、TIMP-1的相对表达量。结果：1.与正常肾组织相比,糖尿病肾病患者肾组织中可观察到肾小管间质损伤及胶原沉积,其肾小管上皮细胞胞膜及胞浆中E-Cadherin表达下降,α-SMA表达上升,评分值有显著差异(P<0.05)。2.与正常组相比,糖尿病肾病大鼠肾间质胶原相对面积增加,肾小管上皮细胞E-cadherin表达减少、α-SMA表达增加(P<0.05)。与糖尿病组相比,大黄酸组及缬沙坦组大鼠肾间质胶原相对面积减少,E-cadherin表达增加、α-SMA表达减少(P<0.05),大黄酸组与缬沙坦组之间无明显差异(P>0.05)。与正常组相比,糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞MMP-9、 TIMP-1表达随病情发展出现变化,MMP-9/TIMP-1比值紊乱。与糖尿病组相比,大黄酸组及缬沙坦组大鼠肾小管上皮细胞MMP-9/TIMP-1比值更接近于正常组(P<0.05),大黄酸组与缬沙坦组之间无明显差异(P>0.05)。与正常组相比,糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞TGF-β1、ILK、 AP-1的表达随病情发生均呈进行性升高(P<0.05)。与糖尿病组相比,大黄酸组及缬沙坦组TGF-β1、ILK、AP-1的表达均降低(P<0.05),大黄酸组与缬沙坦组之间无明显差异(P>0.05)。糖尿病三组大鼠肾小管上皮细胞中AP-1表达与MMP-9/TIMP-1比值呈负相关。3.与正常组相比,高糖环境下培养的HK-2细胞、TGF-β1刺激的HK-2细胞均出现E-cadherin mRNA与蛋白表达减少,α-SMA、ILK mRNA与蛋白表达增加(P<0.05)。使用ILK-siRNA特异性抑制ILK表达后,HK-2细胞出现E-cadherin mRNA与蛋白表达上调,α-SMA、ILK mRNA与蛋白表达减少(P<0.05)。在高糖培养的HK-2细胞中加入大黄酸后,HK-2细胞出现与加入ILK-siRNA类似的改变,二者无明显差异(P>0.05)。与正常组相比,高糖环境下培养的HK-2细胞出现MMP-9/TIMP-1比值紊乱。使用ILK-siRNA特异性抑制ILK表达后,HK-2细胞的MMP-9/TIMP-1比值回归到接近正常(P<0.05),高糖+大黄酸组亦出现类似改变,二者无明显差异(P>0.05)。结论：1.在人糖尿病肾病病变发展过程中,可能存在肾小管上皮细胞转分化现象。2.高糖环境下HK-2细胞与糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞E-cadherin表达减少,α-SMA表达增加,表明在糖尿病肾病(DN)肾小管间质病变进程中,存在肾小管上皮细胞转分化(TEMT)。3.在DN病理状态下,肾小管上皮细胞的ILK表达增高；ILK参与、介导了DN的TEMT过程,特异性抑制ILK可阻抑TEMT过程,调节紊乱的MMP-9/TIMP-1比值,且对TEMT有部分逆转作用。4.大黄酸可下调DN大鼠肾小管上皮细胞及高糖环境下HK-2细胞ILK的表达,改善MMP-9/TIMP-1比值的失衡,并阻抑TEMT的进展；大黄酸对DN中ILK高表达的抑制及其对MMP-9/TIMP-1比值的调节可能是大黄酸肾脏保护作用的机制之一。