肥胖被定义为身体过分增加的脂肪量以至于对身体健康产生有害结果的一种状态。研究表明肥胖与2型糖尿病、代谢综合征、某些癌症、高血压以及脑卒中在内的疾患有关,很清楚的是超重和肥胖的流行带来了巨大的公共卫生问题。依照世界卫生组织(WHO)所制定的肥胖或超重标准,统计表明在西方国家,目前超过半数的成人表现为超重抑或肥胖。近年来在中国由于传统饮食的改变、体力活动强度的下降和静态生活方式的增加导致超重和肥胖人数迅速增加。尽管与美国等西方国家超过半数的成人超重或肥胖相比,中国的肥胖患病率相对较低,但是肥胖病的快速增长,特别是儿童的情况,给我们敲响了警钟。肥胖病是由环境因素和遗传因素共同作用所导致的复杂疾病。尽管当前饮食结构和生活方式的改变导致了全球肥胖发病率的增加,但有证据表明遗传因素在体重的调节中起着关键的作用。肥胖为一种复杂病,复杂病是由多个易感遗传基因与环境因素共同参与且相互作用而致发病,目前阐明多基因决定因素在肥胖人群中参与发病的作用机制并非易事。然而,研究孟德尔遗传模式的单基因突变所致的肥胖为解析肥胖的发病机制提供了帮助。最近,研究发现几种涉及破坏瘦素-黑皮质素通路的单基因突变可导致早发性严重肥胖的发生,他们是:瘦素、瘦素受体、激素原转换酶-1、阿片黑色素促皮质素原和黑皮素4受体基因突变。这些基因编码的蛋白质直接或间接地调控/参与中枢黑皮素通路,从而影响着能量代谢的平衡。然而这些基因突变导致的肥胖多只在白种人群中发现,且除MC4R基因突变发生率较高外,其他基因突变在人群中发生率极低,只在白人人群中个别散发出现。Nishigori等发现小异二聚体伙伴基因突变在日本人群中和轻度肥胖的发生共分离(突变发生率约为6%),证实SHP基因突变和显性遗传的早发性轻度肥胖相关联。尽管缺乏SHP基因突变和日本人成人肥胖发生相关性的研究,但他们推测SHP基因突变是导致日本人肥胖发生的遗传背景成分之一。但随后对白种人的筛查发现功能性SHP基因突变的发生率很低。SHP基因位于1p36.1,SHP由2个外显子及1个内含子构成,其编码257氨基酸(aa)残基构成的蛋白质SHP是核受体超家族的一个成员。由于目前尚未发现相应的配体,所以SHP是一种孤儿核受体,SHP属于一类非典型性的核受体,其和传统意义上的核受体在结构和功能上存在相当大的差异,其缺乏核受体所具有的保守的DNA结合区。迄今,已知涉及调节40多个不同的靶基因,这些靶基因主要涉及胆固醇/胆汁酸代谢,脂肪生成,糖异生,药物代谢及类固醇生成。本实验通过利用直接测序的方法对中国人超重或肥胖人群中SHP基因突变的发生率进行评价,然后利用双荧光素酶报告基因测试系统来检测突变蛋白的功能,最后检测突变携带者的临床病理生理。评估中国人超重或肥胖人群中SHP基因突变的遗传及临床特征,为对SHP基因突变携带者进行早期临床干预提供理论依据。本课题分为三个部分组成。一、中国人超重或肥胖人群中筛查SHP基因突变目的:了解SHP基因突变及变异在中国人超重或肥胖人群中的发生情况以及探讨SHP基因突变携带者表型、突变基因遗传模式和突变的外显性。方法:应用直接测序方法对500例无亲缘关系的超重抑或肥胖患者及272名非糖尿病非肥胖的健康个体进行SHP基因启动子、2个外显子及其侧翼内含子区筛查。结果:通过对500例无亲缘关系超重或肥胖个体进行SHP基因筛查,在编码区共发现11个个体携带5种不同的SHP基因突变位点,并且所有这些突变都是呈杂合状态。其中在超重组所发现的突变:两个先前国外报道过的错义突变G171A和G189E分别在两个不同的个体中被发现;一个先前报道过的无义突变R34X也在该组的一个个体中被发现;一个先前报道过的移码突变H53fsdel10在该组的5个无亲缘关系的个体中被发现;一个位于蛋白N端的新的沉默突变P10P也在该组中被发现。此外,我们在一个超重个体中发现了一个新的杂合变异IVS1+10 C→T。在肥胖组所发现的突变:我们发现2个无亲缘关系的个体携带H53fsdel10突变(2.6%, 2/77)。我们未在272例非糖尿病非肥胖健康正常对照组中发现上述突变。此外,本研究在家系中观察到SHP基因突变并不完全与肥胖或超重共分离,在研究中SHP基因突变的外显率仅为62.5%(15/24)。结论:SHP基因突变可能影响中国人体重的增加及升高的血浆胰岛素水平。二、突变型SHP基因的表达及功能检测目的:研究SHP基因突变蛋白质与正常SHP蛋白质在抑制功能上的差异。方法:本研究通过对携带突变SHP基因表达质粒的构建、鉴定,然后利用SHP蛋白能和核受体HNF-4α结合形成异二聚体并抑制HNF-4α的转录激活功能,而HNF-1α基因作为HNF-4α的靶基因, HNF-4α可以结合到HNF-1α基因上游的启动子部分从而对HNF-1α基因有转录激活功能的原理设计利用双荧光素酶报告基因检测系统来检测SHP基因不同突变位点的功能。结果:通过将携带SHP基因R34X、H53fsdel10、G171A及G189E突变位点的pcDNA3.1-SHP质粒分别和质粒pcDNA-HNF-4α、pGL3-HNF-1α及pRL-SV40共转染MIN-m9及HepG2细胞结果发现携带R34X、H53fsdel10、G189E突变的SHP蛋白在不同的细胞株中其抑制功能均显著低于野生型SHP蛋白;而G171A突变,其在HepG2细胞株中转染,检测结果发现携带该突变的SHP蛋白其抑制功能和野生型SHP蛋白无显著性差异。而在MIN-m9细胞株中转染发现其25ng水平时抑制功能和野生型SHP蛋白无显著性差异,当pcDNA3.1-SHP质粒质量加大5倍后,其抑制功能显著低于野生型SHP蛋白。结论:R34X、H53fsdel10、G171A及G189E突变使SHP的转录抑制能力下降,这些突变可能与中国人超重或肥胖有关。三、SHP基因突变个体的临床病理生理研究目的:进一步研究SHP基因突变携带者的临床病理生理特征,了解SHP基因突变在人体中对糖、脂代谢及其他内分泌激素分泌的影响,为将来对SHP基因突变携带者进行临床诊治提供理论基础。方法:本实验拟通过测定SHP基因突变携带者血中肥胖发生相关的激素水平以研究SHP基因突变是否伴发其他内分泌异常;检测血脂谱水平;以及通过对SHP基因突变携带者进行口服葡萄糖耐量试验和精氨酸试验来评估突变携带者的β细胞功能。结果:通过对6例SHP基因H53fsdel10突变携带者肥胖发生相关的激素的测定发现SHP基因突变携带者肥胖相关激素水平皆在正常范围之内,所有突变携带者肝肾功能正常,血脂谱水平多在正常水平。SHP基因突变携带者表现为高胰岛素血症及胰岛素抵抗。精氨酸试验时,和2分钟时SHP基因突变组胰岛素分泌水平比较,正常对照组、单纯性肥胖组及T2DM伴OB组的胰岛素水平均显著高于SHP基因突变组,而T2DM不伴OB组胰岛素水平显著低于SHP基因突变组,差异均有统计学意义(P<0.01);和4分钟时SHP基因突变组胰岛素分泌水平比较,单纯性肥胖组及T2DM伴OB组的胰岛素水平均显著高于SHP基因突变组,差异有统计学意义(P<0.01),而正常对照组及T2DM不伴OB组胰岛素水平与SHP基因突变组比较则无显著性差异。结论:SHP基因突变不伴随体内其他内分泌异常及血脂紊乱,但可能导致β细胞分泌功能缺陷。