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目的 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是继发于糖尿病的一种微血管并发症,它占全球范围内终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的40%以上,是糖尿病患者死亡的重要原因。有研究表明,细胞焦亡参与了糖尿病及其并发症糖尿病心肌病的发病过程中。而在感染性炎症和胃癌中发生的细胞焦亡是由Gasdermin家族蛋白介导的一种炎症性程序性细胞死亡形式。Gasdermin E(GSDME)在肾脏组织中高表达,细胞焦亡是否参与了糖尿病肾病的发病过程,Gasdermin E是否影响糖尿病肾病中肾脏细胞焦亡尚未见报道,本研究旨在明确GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β在糖尿病肾病中的表达情况和相互作用,探究caspase-3裂解的GSDME诱导的细胞焦亡在糖尿病肾病发病过程中的作用,以期为DN的诊疗、病情监测提供新的靶标。方法 1.一次性腹腔大剂量注射链脲佐菌素(1%STZ,65 mg/kg)构建SD大鼠1型糖尿病肾病动物模型,检测对照组(Ctrl组)大鼠和糖尿病肾病组(DN组)大鼠的血糖、体重、24 h尿量、尿糖和24 h尿蛋白;2.光学显微镜下观察苏木精-伊红(HE)和糖原(PAS)染色后肾脏组织结构的病理变化;3.Western Blot方法检测GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β在Ctrl组和DN组大鼠12周、16周、20周肾脏组织中的蛋白表达水平;免疫组织化学染色检测Ctrl组和DN组大鼠12周、16周、20周肾脏组织中GSDME、caspase-3、caspase-1以及m IL-1β的蛋白表达水平;4.ELISA方法检测Ctrl组大鼠和DN组大鼠12周、16周、20周静脉血中m IL-1β的蛋白浓度;5.TUNEL染色检测Ctrl组大鼠和DN组大鼠12周、16周、20周肾脏组织中肾脏组织中焦亡细胞的阳性率;6.相差显微镜观察高糖刺激的人肾小管上皮细胞(HK2细胞)和大鼠肾小球系膜细胞(RGMCs细胞)的形态变化;7.HK2细胞和RGMCs细胞经高糖刺激0、12、24、36、48 h,Real-Time PCR方法检测GSDME、caspase-3、caspase-1以及IL-1β的核酸表达水平;Western Blot方法检测GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β的蛋白表达水平;ELISA方法检测高糖刺激不同时间点的细胞培养上清液中m IL-1β的蛋白浓度;8.GSDME-si RNA、caspase-3-si RNA和caspase-1-si RNA干扰后高糖刺激48 h,Western Blot方法检测GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β的蛋白表达水平;ELISA方法检测细胞培养上清液中m IL-1β的蛋白浓度。结果 1.成功构建SD大鼠1型糖尿病肾病动物模型:DN组大鼠随机血糖高于16.7m M,可见“多尿”症状。DN组大鼠随机血糖浓度和24 h尿量明显高于Ctrl组大鼠,STZ注射8周后24 h尿蛋白明显升高,而体重明显低于Ctrl组大鼠;2.PAS染色结果表明,与Ctrl组相比DN组大鼠肾脏系膜扩张、细胞外基质积聚;HE染色结果表明,DN组大鼠肾脏组织结构紊乱、肾小管肥大和间质损伤;3.Western Blot方法检测发现,与Ctrl组相比DN组大鼠肾脏中caspase-3的活化体p17的蛋白表达水平呈时间依赖性显著升高,20周达到最高;GSDME的N末端裂解片段GSDME-N的表达在16周有所增加,在20周有显著增加;caspase-1的活化体p20的蛋白表达水平呈时间依赖性升高,20周达到最高;m IL-1β的蛋白表达水平在12周时显著升高,在16周和20周时明显降低。免疫组织化学染色发现,与Ctrl组相比DN大鼠肾组织中GSDME,caspase-3和caspase-1蛋白表达均增高,m IL-1β的蛋白表达水平在12周时显著升高,随后随时间的延长在16周和20周时降低;ELISA检测结果显示,DN组大鼠相较于Ctrl组大鼠16周和20周静脉血中m IL-1β的蛋白浓度明显增加;4.TUNEL染色结果显示,DN组大鼠20周肾脏组织中TUNEL阳性细胞数目增加;5.相差显微镜观察结果显示,高糖刺激48 h后与对照组(NG组)相比高糖组(HG组)HK2细胞和RGMCs细胞的形态明显肿胀,并在质膜上出现特征性大气泡;6.HK2细胞及RGMCs细胞经高糖刺激后caspase-3、GSDME、caspase-1和IL-1β的m RNA表达水平明显升高;Western Blot检测结果显示HK2细胞及RGMCs细胞经高糖刺激后,HG组GSDME-N、p17和p20的蛋白表达水平明显高于NG组;HG组m IL-1β蛋白表达水平在24 h增加到峰值后开始下降,与此同时相应细胞培养上清液中的m IL-1β浓度从36 h开始以时间依赖性的方式增加;7.与NC-si RNA组比,GSDME-si RNA干扰组的细胞内m IL-1β的蛋白水平增高,而相应的细胞培养上清液中m IL-1β的蛋白浓度降低;8.与NC-si RNA组相比caspase-3和caspase-1双干扰组中,GSDME-N、caspase-1和p20、caspase-3和p17的蛋白水平显著降低;细胞内m IL-1β的蛋白水平明显高于NC-si RNA组和caspase-1干扰组,低于caspase-3干扰组;caspase-3和caspase-1双干扰组中细胞上清液中的m IL-1β浓度均较其他组降低。结论 1.成功构建1型糖尿病肾病SD大鼠动物模型;2.糖尿病肾病中肾脏细胞发生了细胞焦亡,细胞焦亡引发m IL-1β的释放增加在糖尿病肾病的炎性相关发病机制中发挥重要作用;3.caspase-3裂解GSDME诱发细胞焦亡同时增加m IL-1β的释放是糖尿病肾病发病机制之一。