传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)属于虹彩病毒科(iddoviridae)肿大细胞病毒属(Megalocytivirus),是导致鳜(Siniperca chuatsi)暴发性死亡的重要病原,给我国鳜养殖业造成严重的经济损失。本实验室于2001年成功完成了ISKNV全基因组序列测定、ORF划分和序列分析工作,为ISKNV基因进行更深入研究奠定了基础。经生物信息学分析,在ISKNV基因组中存在多个锚蛋白重复序列家族基因(ankyrin repeat gene familyprotein),这些基因在ISKNV感染中的作用尚未清楚.本论文选取了其中一个锚蛋白重复序列家族基因ORF125进行功能研究。　　 本文首先通过RACE技术成功获得了ISKNV ORF125基因的cDNA序列,并对ORF125的翻译起始点位置进行了更正。更正后的ORF125大小为825bp,编码大小为29.4kDa的蛋白。同时制备了ORF125蛋白的抗体,并以此抗体进行Western blot,证实了ORF125蛋白在病毒感染的细胞中表达。ISKNV感染后ORF125的转录时相分析表明,ORF125为晚期基因。　　 通过pull-down实验,我们从斑马鱼(Danio rerio)总蛋白中鉴定出一个可与ORF125蛋白在体外结合的蛋白IKKβ。通过简并引物和RACE的方法,克隆了鳜IKKβ,并对此基因进行了序列的分析和特性的鉴定。随后,我们采用免疫共沉淀的方法证实ORF125蛋白与IKKβ的相互作用。由于IKKβ是NF-κB信号通路的重要分子,我们借助人类细胞系统深入研究了ISKNV ORF125与NF-κB的关系。首先通过荧光素酶报告基因系统实验,发现ORF125蛋白可抑制TNFα和PMA对NF-κB的激活,但对AP-1信号影响不大。Western blot检测也显示ORF125蛋白可抑制IκBα的磷酸化和NF-κB的核转位。综合这些结果表明ISKNVORF125蛋白抑制NF-κB信号通路的靶点在IKK复合物处。另外,我们采用免疫共沉淀的方法,从293T细胞总蛋白中找到ORF125的另一相互作用的蛋白GSTP1,推测ORF125可能是一个多功能基因。　　 为探寻ISKNV ORF125在实际感染过程中的作用,本文进一步研究了ISKNV与宿主NF-κB的关系。通过实时定量PCR检测NF-κB调控的基因IL8、TNFα、CC型趋化因子和IL-1β在ISKNV感染过程中的表达水平,我们发现这些基因表达水平均整体上升,且呈现相似的变化规律,间接揭示了NF-κB信号通路的变化情况。利用免疫荧光、实时定量等方法,证实在适当的时段利用NF-κB激活抑制剂处理可有效抑制ISKNV的感染,表明NF-κB信号通路对ISKNV感染起着至关重要的作用。　　 通过对ISKNV及其ORF125与NF-κB关系的研究,将有助于揭示ISKNV感染细胞的分子机理和抗病毒药物的开发。