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目的 血脑屏障(BBB)的存在极大的限制了大分子药物通过血脑屏障进入脑组织，如何转运大分子药物通过血脑屏障是中枢神经系统疾病治疗亟待解决的一个关键问题。血脑屏障在正常生理条件下只允许气体分子及相对分子质量小于0.6kD的脂溶性小分子通过。药物通过血脑屏障进入脑组织主要有两条途径:跨细胞途径（增加吞饮小泡的数量）和细胞旁途径（开放紧密连接）。 Endophilin-1是1996年从白血病儿童的血液中克隆的。它主要存在于脑组织中，参与突触囊泡的内陷(invagination)、剪切(fission/scission)，从而调节囊泡内吞回收。近期研究显示Endophilin-1在肾脏组织中表达，并且调控足细胞的发育、形成，调控肾滤过膜屏障的通透性，提示Endophilin-1可能参与屏障通透性的调节。另外，有研究提示Endophilin-1参与细胞表面EGFR的内吞和降解过程，影响EGFR-ERK1/2通路的活性，而ERK1/2参与调节紧密连接相关蛋白的表达，进而影响通透性。目前对于Endophilin-1能否通过影响EGFR-ERK1/2通路的活性调节血脑屏障通透性的研究尚未见报道。 MicroRNA作为长度约为20-24个核苷酸的小RNA，不编码蛋白质。miRNAs与下游靶基因的信使RNA的3非翻译区(3-UTR)结合，抑制信使RNA的表达，导致靶基因的表达下调。很多MicroRNA在脑组织的生理和病理状态存在表达差异。近年来，在神经系统退行性病变中MicroRNA表达及功能研究越来越得到关注。2008年发现miR-107在阿尔茨海默病(AD)脑组织中表达下调。同时有研究证实，Endophilin-1在AD患者早期的脑组织中即出现表达上调。软件预测miR-107和Endophilin-1的3-UTR存在结合位点。所以我们推测，在AD中，miR-107下调可能引起Endophilin-1表达上调。另外，AD患者脑组织标本和动物模型中均发现BBB通透性增大。鉴于Endophilin-1可能参与BBB通透性调节，因此我们推测，miR-107可能通过介导Endophilin-1参与AD的BBB通透性调节。 我们的研究目的是检测Endophilin-1是否在人微血管内皮细胞中表达，进而研究Endophilin-1是否调控血脑屏障通透性以及可能的分子机制，为选择性开放血脑屏障提供新的靶点。另外，明确miR-107在Aβ1-42孵育的体外血脑屏障模型中表达，并且研究miR-107是否介导Endophilin-1参与调节Aβ1-42孵育的体外血脑屏障通透性及其机制。 方法 第一部分Endophilin-1调控血脑屏障通透性机制研究 1、分别构建Endophilin-1、ZO-1、occludin的过表达和表达沉默质粒。 2、构建体外血脑屏障模型。 3、Westernblot检测Endophilin-1的表达，免疫荧光检测Endophilin-1的细胞定位。 4、应用Millicell-ERS电阻测量系统检测Endophilin-1过表达或表达沉默后血脑屏障的跨内皮细胞电阻值(transendothelialelectricresistance，TEER)的变化，应用葡聚糖通透性实验检测血脑屏障通透性变化。 5、Westernblot测定Endophilin-1过表达或表达沉默后ZO-1、occludin、EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2表达量的改变。 6、免疫荧光测定Endophilin-1过表达或表达沉默后EGFR、ZO-1、occludin的定位及表达变化。 7、应用免疫共沉淀方法测定Endophilin-1和EGFR互作。 第二部分miR-107通过下调Endophilin-1的表达调节阿尔茨海默病血脑屏障通透性机制研究 1、CCK-8细胞活力和增殖实验检测不同浓度的Aβ1-42作用不同时间对人脑微血管内皮细胞细胞活力的影响。 2、辣根过氧化物酶（HRP）渗透性实验检测Aβ1-42孵育体外BBB通透性。 3、Real-timePCR检测miR-107在Aβ1-42孵育的体外血脑屏障模型中表达。 4、HRP渗透性实验检测沉默miR-107对Aβ1-42孵育的体外血脑屏障模型通透性的影响。 5、Westernblot检测沉默miR-107对紧密连接相关蛋白ZO-1和Occludin表达的影响。 6、荧光素酶报告基因检测miR-107和Endophilin-1的3非翻译区直接结合。 7、Real-timePCR和Westernblot验证miR-107调控Endophilin-1表达。 8、Endophilin-1参与miR-107调控Aβ1-42孵育的体外血脑屏障模型通透性改变。 结果 第一部分Endophilin-1调控血脑屏障通透性机制研究 1、Endophilin-1在人微血管内皮细胞中内源性表达。 2、Endophilin-1参与调控血脑屏障通透性。Endophilin-1过表达导致人脑微血管内皮细胞通透性增高，Endophilin-1表达沉默导致人脑微血管内皮细胞通透性降低。 3、Endophilin-1调控紧密连接相关蛋白的表达。Endophilin-1过表达引起ZO-1、occludin表达量下调，Endophilin-1表达沉默引起ZO-1、occludin表达量上调。 4、ZO-1、occludin表达量的变化影响血脑屏障通透性。Endophilin-1过表达组细胞转染ZO-1或occludin过表达质粒，可部分阻断Endophilin-1过表达所导致的通透性增加。Endophilin-1表达沉默组细胞转染ZO-1或occludin表达沉默质粒，可部分阻断Endophilin-1表达沉默所导致的通透性减小，对ZO-1的阻断程度大于occludin。 5、Endophilin-1可以影响EGFR-ERK1/2通路活性。免疫荧光示Endophilin-1与EGFR存在共定位;免疫共沉淀示Endophilin-1与EGFR互作;Endophilin-1过表达引起EGFR、p-ERK1/2表达量下调，Endophilin-1表达沉默引起EGFR、p-ERK1/2表达量上调。 6、EGFR-ERK1/2通路抑制剂可以阻断Endophilin-1沉默导致的通透性下调。应用AG1478（EGFR抑制剂）、PD98059(ERK1/2抑制剂)之后可以明显阻断Endophilin-1沉默导致的BBB通透性下调。 7、EGFR-ERK1/2通路抑制剂可以阻断Endophilin-1沉默导致的ZO-1或occludin表达上调。应用AG1478（EGFR抑制剂）、PD98059(ERK1/2抑制剂)之后可以明显阻断Endophilin-1沉默导致的ZO-1或occludin表达上调。 第二部分miR-107通过下调Endophilin-1的表达调节阿尔茨海默病血脑屏障通透性机制研究 1、Aβ1-42导致体外血脑屏障模型通透性增大。 2、miR-107在Aβ1-42孵育的体外血脑屏障模型中表达下调。 3、沉默miR-107导致Aβ1-4孵育的体外血脑屏障模型通透性增大。 4、沉默miR-107导致紧密连接相关蛋白ZO-1和Occludin表达下调。 5、miR-107和Endophilin-1的3非翻译区直接结合。 6、沉默miR-107上调Endophilin-1的mRNA和蛋白表达。 7、Endophilin-1参与miR-107调控Aβ1-42孵育的体外血脑屏障模型通透性改变。 结论 第一部分Endophilin-1调控血脑屏障通透性机制研究 1、Endophilin-11在人脑微血管内皮细胞中表达。 2、Endophilin-1的表达变化影响血脑屏障通透性。 3、Endophilin-1的表达变化影响紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的表达。 4、Endophilin-l在人脑微血管内皮细胞中介导EGFR的内吞和降解，调节EGF-ERK1/2通路的活化状态 5、Endophilin-Ⅰ通过EGF-ERK1/2通路调控BBB通透性和紧密连接相关蛋白0-1、occludin的表达。 第二部分miR-107通过下调Endophilin-1的表达调节阿尔茨海默病血脑屏障通透性机制研究 1、miR107在Aβ1-42孵育的体外血脑屏障模型中表达显著下调。 2、沉默miR107导致Aβ1-42孵育的体外血脑屏障通透性增加和紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的表达下调。 3、沉默miR107导致Aβ1-42孵育的体外血脑屏障的内皮细胞Endophilin-Ⅰ的表达上调。 4、miR-107和Endophilin-1的3非翻译区特异性结合 5、Endophilin-Ⅰ作为miR-107下游靶基因参与Aβ1-42孵育的体外血脑屏障通透性的调控。