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第一章大鼠脊髓缺血再灌注模型的建立目的建立大鼠脊髓缺血再灌注模型。方法选取15只成年健康雄性SD大鼠作预实验,选取15只成年健康雄性SD大鼠作正式实验。大鼠10%水合氯醛麻醉,固定于实验台上。手术过程中以烤灯保温,使肛温维持在38℃左右。腹部手术区备皮,消毒,取腹正中线作切口,暴露腹主动脉,分别游离左肾动脉下及左、右髂总动脉分叉以上的腹主动脉。尾静脉注射肝素抗凝。动脉夹夹闭腹主动脉上、下端,90 min后开放,逐层关腹。术后肌注青霉素预防感染。大鼠完全清醒后放入单笼饲养。于再灌注6、12、24h观察大鼠并对其后肢运动功能进行评分,0分,后肢无活动,不能负重；1分,后肢可见活动但不能负重；2分,后肢活动频繁或有力,不能负重；3分,后肢可支持体重,能走1-2步；4分,可行走,仅有轻度障碍；5分,行走正常。取再灌注24h大鼠的L2-L5节段脊髓组织作HE染色。结果15例预实验中,有9例存活,6例死亡。在成功建立的9例模型中,再灌注6h的Tarlov评分为0.78+0.83,再灌注12h的Tarlov评分为1.11+0.60,再灌注24h的Tarlov评分为1.67±0.70。15例正式实验中,15例均存活。再灌注6h的Tarlov评分为0.93+0.79,再灌注12h的Tarlov评分为1.60±0.51,再灌注24h的Tarlov评分为2.00±0.655。脊髓缺血再灌注6h后可见神经元肿胀,胞浆淡染,染色质边集。脊髓缺血再灌注12h可见神经元肿胀程度严重,胞浆有大量空泡形成,部分神经元核仁不清,周围间隙增宽。脊髓缺血再灌注24h可见神经元及神经胶质细胞损伤,较12h损伤程度重。结论通过阻断大鼠肾动脉水平的腹主动脉90min成功建立大鼠脊髓缺血再灌注模型。第二章 腺苷预处理对大鼠脊髓缺血再灌注后bcl-2、bax、 GRP-78、caspase 12表达的影响目的截瘫是胸腹大动脉手术后的一种严重并发症,其发生的主要原因是脊髓缺血再灌注损伤,尤其是夹闭胸腹主动脉所致的迟发性神经细胞死亡。为了减少这一并发症的发生,人们采取了多种措施：控制缺血时间,脊髓缺血段的降温,脑脊液引流,脊髓旁组织灌注预冷溶液以及应用抗氧化剂或其他药物等。腺苷作为心脏外科手术中的保护剂,可减轻心肌再灌注损伤,但其能否减轻术后脊髓损伤仍有待研究。通过观察腺苷对大鼠脊髓缺血再灌注后细胞凋亡及B细胞白血病/淋巴瘤-2(bcl-2)、B细胞白血病/淋巴瘤-2相关蛋白X(bax)、葡萄糖调节蛋白-78(GRP-78)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶12(caspase 12)表达的影响,探讨其对脊髓损伤的保护作用。方法27只成年健康雄性SD大鼠随机分成3组：对照组(A组)；缺血再灌注组(B组)；腺苷预处理组(C组)。大鼠10%水合氯醛麻醉,固定于实验台上。手术过程中以烤灯保温,使肛温维持在38℃左右。腹部手术区备皮,消毒,取腹正中线作切口,暴露腹主动脉,分别游离左肾动脉下及左、右髂总动脉分叉以上的腹主动脉。尾静脉注射肝素抗凝。动脉夹夹闭腹主动脉上、下端,90 min后开放,逐层关腹。术后肌注青霉素预防感染。大鼠完全清醒后放入单笼饲养。于再灌注6、12、24h观察大鼠并对其后肢运动功能进行评分,0分,后肢无活动,不能负重；1分,后肢可见活动但不能负重；2分,后肢活动频繁或有力,不能负重；3分,后肢可支持体重,能走1-2步；4分,可行走,仅有轻度障碍；5分,行走正常。取L2-L5节段脊髓,置于4%多聚甲醛中固定,作苏木素-伊红(HE)染色,Nissl染色,并在光学显微镜下观察。取各组脊髓标本石蜡连续切片各1张,脱蜡,蛋白酶K孵育,加入TUNEL反应液孵育,然后滴加Converter-POD溶液孵育。二氨基苯联胺(DAB)显色,苏木素复染,封片后光镜观察。将2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定后的脊髓移入4℃的1%锇酸溶液中固定1h,乙醇、丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋聚合,制作成超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铅双重染色,于H-600型透射电镜下观察脊髓中神经元及神经胶质细胞的超微结构。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术和固相免疫测定法。用电子天平称取各组脊髓标本100mg,剪碎,加入裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF),用组织匀浆器匀浆,将其4℃离心得到上清,即总蛋白。测定蛋白浓度后,进行SDS-PAGE电泳,聚偏氟乙烯(PVDF)膜进行蛋白转印,封闭液封闭。加入稀释好的bcl-2一抗(1：1000)、bax一抗(1：4000)、GRP-78一抗(1：3000)、caspase 12—抗(1：1000)4℃过夜,以β-肌动蛋白(β-actin)抗体作为内参照,洗膜后分别加入相应的羊抗兔二抗(1：5000)室温孵育1 h,增强化学发光(ECL)显色剂显色。应用Gelpro32软件分析结果条带的积分吸光度,计算相对表达量。RT-qPCR检测：Trizol提取细胞总RNA,用总RNA 4.0μg进行逆转录,体系中分别加入bcl-2、bax、β-actin基因的引物,合成的cDNA直接用于PCR扩增反应。PCR反应条件：94℃变性3 min后,94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃30 s,30次反复循环扩增,最后72℃延伸10 min。荧光定量PCR反应体系为20.0 μl,反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s,44个循环。溶解曲线分析温度设定为72.0℃-94.0℃。PCR反应在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司)上进行,扩增曲线、标准曲线及溶解曲线由仪器自动绘制。采用Primer Premier 5.0设计引物,序列如下：bcl-2引物序列：上游：5’-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3’,下游：5’-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3’,223bp；bax引物序列：上游：5’-CTGCAGAGGATGATTGCTGA-3’,下游：5’-GATCAGCTCG GGCACTTTAG-3’,174bp；GRP-78引物序列：上游：5’-TGACTCCAGCAGAGCCCTAT-3’,下游： 5’-TTGGGAGAACCATTGAGAGG- 3’,197bp；caspase12引物序列：上游：5’GCTGCCAAGAGAACACATGA-3’,下游：5’--GGTTCTCAGCTTTGCTCAGG-3’,1 69bp；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列：上游：5’-TGCCACTCAGAA GACTGTGG-3’,下游：5’-TTCAGCTCTGGGATGAC CTT-3’,129bp.在GAPDH作内参照条件下,检测bcl-2和bax mRNA的表达。结果HE染色及NISSL染色结果：A组神经元胞体大,胞浆丰富,染色均匀,无出血水肿,未见炎症细胞浸润,尼氏体着色正常；B组可见神经元肿胀,胞浆淡染,部分神经元核仁不清,周围间隙增宽,尼氏体不清；C组神经元胞体轮廓清晰,核仁清晰,周围间隙增宽,但损伤较B组明显减轻。电镜检测结果：A组可见细胞核核膜完整,染色质分布均匀,核周细胞器正常,髓鞘排列规律整齐,轴索均匀一致；B组细胞核皱缩,染色质边集,髓鞘松散,轴索与髓鞘间有孔隙,空泡多见；C组细胞核核膜完整,染色质分布均匀,髓鞘完整但稍松散,轴索均匀,基质中少见空泡。TUNEL染色结果：A组神经元染色均匀,偶见阳性细胞；B组可见大量含紫蓝色颗粒的阳性细胞,C组阳性细胞较B组少。Western blot检测结果： bcl-2蛋白在B组表达最弱,C组比B组蛋白表达水平增高。bax蛋白在B组表达最强,与B组相比,C组蛋白表达水平降低。C组bcl-2/bax表达水平高于B组,差异有统计学意义(P<0.01)。A组bcl-2/bax表达水平高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.01)。C组GRP-78蛋白表达水平高于B组,差异有统计学意义(P<0.01)。B组、C组caspase 12蛋白表达均高于A组,差异有统计学意义(P<0.01)。C组 caspase12蛋白表达水平低于B组,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR检测结果：凋亡抑制基因bcl-2在B组表达最弱, C组较B组表达量增高。凋亡基因bax在B组表达最强,与B组相比,C组表达量降低。C组bcl-2/bax表达水平高于B组,差异有统计学意义(P<0.01)。A组bcl-2/bax表达水平高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.01)。GRP-78在B组表达最弱, C组较B组表达量增高,差异有统计学意义(P<0.01)。凋亡基因caspase 12在B组表达最强,与B组相比,C组表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论再灌注24h后,腺苷预处理组脊髓组织中凋亡细胞较缺血再灌注组少,说明腺苷可以抑制细胞凋亡。腺苷预处理组脊髓组织中bcl-2/bax表达水平高于脊髓缺血再灌注组,说明腺苷可以通过上调bcl-2的表达,降低bax的表达,进而抑制细胞凋亡。腺苷还能通过上调GRP-78的表达,下调caspase 12的表达,抑制内质网应激反应的发生,进一步抑制脊髓神经元及神经胶质细胞的凋亡