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目的：急性髓系白血病是一类异质性血液系统疾病,其发生和发展与造血干细胞的成熟分化障碍、恶性克隆有关。t(8；21)(q22；q22)易位是AML中最常见的细胞遗传学改变,其易位形成AML1-ETO融合基因,转录翻译为AML1-ETO融合蛋白。尽管该类白血病均携带t(8；21)(q22；q22)易位,具有相对均一的遗传学背景,但该型白血病本身存在非常强的异质性。造成异质性较大的根本原因在于研究机制不清楚。表观遗传因素参与AML1-ETO阳性白血病发生发展：ETO募集转录抑制复合物N-CoR/SMRT/Sin3/HDAC,抑制下游基因的表达；AML1-ETO与其他转录因子(例如：CEBPα、PU.1和MEF)通过相互作用而抑制或激活下游基因的表达;PRMT1甲基化AML1-ETO9a融合蛋白142位精氨酸,促进Kasumi-1细胞中的转录激活。乙酰化AML1-ETO融合蛋白43位赖氨酸,促进白血病细胞的自我更新。组蛋白甲基化在该型白血病中的作用尚没有报道。生物信息学TCGA表达谱芯片提示Ezhl (Enhancer of zeste homolog 1)在t(8;21)AML中表达高于正常核型AML, Ezhl维持造血干细胞多能性,Ezhl敲除骨髓呈衰竭状态。揭示了Ezhl与造血系统的重要联系,Ezhl在白血病中的作用尚不明确。本实验目的是探讨Ezhl与AML1-ETO的关系,Ezhl在t(8;21)AML中的生物学功能。方法：实时定量PCR (Real-Time Quantitative PCR)检测Ezhl的mRNA表达水平; Western blot检测Ezhl的蛋白表达水平。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,ColP)和Western blot实验检测AML1-ETO和Ezhl是否相互结合。转染siRNA沉默EZH1,流式细胞仪检测转染效率,克隆形成实验检测细胞增殖情况。为了研究Ezhl在体内的功能,裸鼠皮下注射转染空载体的SKNO-1细胞和转染siRNA48h的SKNO-1细胞,观察肿瘤体积、重量和白血病骨髓、肺、肝和脾浸润情况。结果：Ezhl在t(8；21)AML的细胞系和患者中mRNA和蛋白水平特异性高表达.AML1-ETO与Ezhl结合形成相互作用复合物。在Kasumi-1和SKNO-1细胞中,用siRNA沉默Ezhl的表达后克隆数目形成减少。在裸鼠成瘤实验中.实验组注射转染siEzhl 48h的SKNO-1细胞.对照组注射转染空载体48h的SKNO-1细胞,每组6只。在成瘤速度上对照组在24天可以测到肿瘤大小,siEzhl组肿瘤在第45天可以测到肿瘤大小。siEzh1组的肿瘤体积和成瘤速度明显小于和慢于空载组。siEzhl组vs对照组肿瘤重量：68±23mg vs 262±64 mg, P<0.05,两组肿瘤重量有明显差异,siEzh1组肿瘤明显小于空载组。siEzhl组骨髓形态和病理切片,低倍镜观察siEzhl组白血病细胞在骨髓、肺、肝和脾的浸润明显少于对照组。结论：Ezhl在t(8;21)AML中高表达;AML1-ETO与Ezhl结合成相互作用的复合物;Ezhl促进t(8;21)AML细胞增殖,发挥癌基因作用,是潜在治疗新靶点。目的：二代外显子测序技术是肿瘤研究进展的一个里程碑,通过二代外显子测学技术发现的基因突变,对了解急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)发病机制和指导治疗分层有重要意义。t(8；21)(q22；q22)易位是AML中最常见的细胞遗传学改变,t(8;21)AML易位产生AML1-ETO融合基因,AML1-ETO单独表达不能引起白血病,需与其它基因突变共同作用才能引起AML。相比其它类型AML, t(8;21)AML更容易发生重现性基因突变,因此筛选该类疾病中新的突变非常重要。根据NCCN-2015-AML-V1预后分层.t(8;21)AML或合并KIT以外突变,均预后良好；1/3的患者合并KIT突变,预后中等。但是从临床流行病学角度分析,t(8;21)AML是一类异质性较大的白血病,原因尚不明确。因此筛选t(8;21)AML的突变基因对于未来疾病分层具有十分重要的意义。本研究目的是：二代外显子测序技术在白血病中的应用价值,发现初治t(8;21)AML和复发基因突变分布规律,初治和复发的克隆演变。方法：我们设计的NimbleGen甫获芯片,覆盖了下列111个基因外显子区域：WHO-2008年指南和NCCN-2014年指南中有关AML的突变基因.基础研究已证实与AML相关的始动突变基因和已有芯片的所覆盖的突变基因。部分基因覆盖全部的外显子区域。用Kasumi-1和SKNO-1预混不同细胞比例评估二代外显子芯片技术的检测敏感性。NimbelGen捕获芯片的测序平台是Illumina Hiseq,检测了33例t(8;21)AML骨髓样本;用Varscan2方法,采用初治-缓解和复发-缓解配对分析策略,得到初治以及复发的突变,再根据79例正常人数据库以及其他方式筛选得到有害性突变并筛选重现性突变。结果：我们用Kasumi-1和K562两种细胞系按一定比例预混后.进行敏感性分析。在1600×的深度下,3%的混合浓度下,纯合突变的检出率为100%,杂合突的检出率大于95%。分析18例t(8;21)AML突变情况,突变频率最高的是KIT,其次是ASXL1、FLT3、KDM6A、NRAS、PHF6和RAD21-AS1。初治的基因突变包括：PHF6、KDM6A、FLT3、SH2B3、RAD21、MEF2B、IDH2、IDH1、CBL和ETV6。复发的基因突变包括：SETD2、IKZF1、FLT3-ITD。初治和复发共有的突变基因包括:KIT、RAD21-AS1、NRAS、ASXL1。在18例t(8;21)AML样本中,有3个样本是成对的,#1-初治合并的突变是NRAS和FLT3,#1-复发合并的突变是FLT3-ITD;#2-初治FLT3,#2-复发合并的突变是NRAS和IKZF1,推测#1和#2患者可能存在克隆演变。#7-初治和#7-复发均为KIT突变.推测#7患者的复发是原白血病主克隆复发。结论：用二代白血病外显子芯片检测敏感性高,在t(8;21)AML中.发现除KIT以外的基因突变,初步探索了初治和复发的基因突变,有助于分析疾病的克隆演变。