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背景卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤,严重威胁妇女生命和健康,恶性程度高、起病隐匿、发现晚、易转移、预后差是卵巢癌的特点。大约70%的患者就诊时已经是晚期(FIGO分级Ⅲ-Ⅳ期)。肿瘤细胞减灭术和以顺铂为基础的联合化疗是晚期卵巢上皮性癌综合治疗的重要手段,肿瘤细胞减灭术的目的是最大限度和范围地切除肿瘤组织,但术后可能残留的病灶仍然无法避免,且成为卵巢癌复发的重要因素。因此化疗的应用使卵巢癌的治疗效果大为改观,患者生存质量明显改善,但综合来看,患者5年内的生存率不超过30%,卵巢癌对化疗药物耐药是导致患者治疗失败的主要原因。目前卵巢上皮性癌主要采用以顺铂为基础的化疗方案,但是顺铂的疗效会因癌细胞内在或者后天(药物诱导)获得的耐药性而减弱。因此,逆转卵巢癌耐药及卵巢癌耐药机制的深入研究尤为重要。目前,分子靶向治疗已逐渐成为一种新的肿瘤治疗策略,并取得一定的研究成果。本题组前期采用全细胞差减法成功筛选获得了与卵巢癌上皮细胞特异性结合的短肽(ovarian cancer specific binding peptide,OSBP),通过原核表达的方法成功获得了靶向融合肽﹛转录反式激活因子(trans-activator of transcription,TAT)-OSBP-丝裂原活化蛋白激酶激酶6突变体(E)[mitogen-activated protein kinase k inase 6 mutant(E),MKK6(E)]﹜,TAT-OSBP-MKK6(E),是一种靶向卵巢癌上皮细胞的具有强穿膜能力的靶向融合肽,体内实验证明其能靶向介导卵巢癌细胞的凋亡,增强紫杉醇的抗肿瘤效应。本研究拟在前期研究的基础上,以人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP为研究对象,进一步探讨TAT-OSBP-MKK6(E)对人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP生长的抑制作用及其可能的机制,并将其与顺铂联合应用于SKOV3/DDP细胞,观察两者的联合抗肿瘤效应,为探索新的靶向杀灭卵巢癌细胞的药物提供实验数据,为逆转卵巢癌顺铂耐药的研究提供理论依据。目的利用人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP细胞为研究对象,探讨融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)单用或与顺铂(DDP)联用对SKOV3/DDP细胞的抑制作用及其可能的分子机制。方法(1)利用MTT法检测融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)对耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP的生长抑制作用,用transwell检测融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)对耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP的侵袭与转移的影响;Western blot分析P38MAPK蛋白的表达;(2)MTT法检测融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)联合顺铂对耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP抑制作用是否增强,光镜下观察TAT-OSBP-MKK6(E)联合顺铂对SKOV3/DDP细胞的形态变化;流式细胞术检测TAT-OSBP-MKK6(E)联合顺铂对SKOV3/DDP的凋亡率的影响,Western blot分析细胞Cleaved caspase-3蛋白的表达;(3)MDC染色标记TAT-OSBP-MKK6(E)诱导SKOV3/DDP发生自噬的自噬体;Western blot分析细胞LC3-II蛋白的表达;利用自噬特异性抑制剂氯喹检测TATOSBP-MKK6(E)诱导SKOV3/DDP发生自噬的作用(4)利用P38MAPK信号通路特异性抑制剂SB230580阻断P38MAPK信号通路后,检测P38蛋白和LC3-II蛋白的表达,MTT法检测SKOV3/DDP细胞的生存率。结果1.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)对耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP的生长抑制作用以2.5、5、10、20、40和80μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)处理SKOV3/DDP细胞48h,出现明显的增殖抑制作用,且呈浓度依赖性。不同的浓度的TAT-OSBPMKK6(E)处理组与对照组相比较,均具有统计学意义(P<0.01),其IC50为2 6.9 4μm o l/m L。2.Transwell检测融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)对耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP的侵袭与转移的能力以0、10、20和40μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)处理SKOV3/DDP细胞48h后,各处理组穿膜细胞数依次为(85±4)、(70±5)、(54±6)和(32±2)个,随TAT-OSBPMKK6(E)浓度的增加,其对SKOV3/DDP的侵袭抑制作用越明显。不同的浓度的TATOSBP-MKK6(E)处理组与对照组相比较,均具有统计学意义(P<0.05)。同样迁移作用中,各处理组迁移细胞数依次为(708±15)、(683±14)、(141±15)和(113±18)个,随TAT-OSBP-MKK6(E)浓度的增加,其对SKOV3/DDP的迁移抑制作用越明显。不同的浓度的TAT-OSBP-MKK6(E)处理组与对照组相比较,均具有统计学意义(P<0.05)3.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)对耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP中P38MAPK的蛋白的表达TAT-OSBP-MKK6(E)在(0-40)μmol/ml的各浓度中可以显著激活SKOV3/DDP细胞中的磷酸化水平,并随药物浓度的增加磷酸化水平越明显,且P38MAPK的总量并无改变。4.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)增加耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP对顺铂的敏感性5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)单作用于SKOV3/DDP细胞的生存抑制率为(13.06±1.089)%,此次20μg/ml顺铂对SKOV3/DDP细胞的生存抑制率为(19.02±2.227)%,TAT-OSBP-MKK6(E)(5μmol/ml)+顺铂(20μg/ml)可以显著提高SKOV3/DDP细胞的生存抑制率达到(54.03±2.382)%。在倒置光学显微镜下观察结果显示,顺铂联合TAT-OSBP-MKK6(E)能够显著抑制SKOV3/DDP细胞的增殖,SKOV3/DDP细胞数量明显减少,细胞形态发生改变,皱缩,细胞呈现为明亮的圆点。5.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)增加耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP细胞凋亡率20μg/ml的顺铂,5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)联合作用SKOV3/DDP细胞24h,利用流式细胞术检测细胞凋亡率。检测结果发现,与对照组相比,20μg/ml顺铂并不能引起SKOV3/DDP细胞发生明显凋亡,5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)能引起细胞凋亡率增加,但作用不明显,而顺铂联合TAT-OSBP-MKK6(E)引起细胞凋亡率明显增高。联合组分别与顺铂组、融合蛋白组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但对照组及20μg/ml的顺铂组比较,顺铂联合TAT-OSBP-MKK6(E)并没有导致Cleaved Caspase-3蛋白表达增强,同样单用5μmol/ml TAT-OSBP-MKK6(E)组中Cleaved Caspase-3蛋白表达减弱。6.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)诱导耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP细胞自噬20μg/ml的顺铂、5μmol/ml TAT-OSBP-MKK6(E)联合组呈现了更高的荧光强度和更多的MDC标记的细胞。western blot检测当20μg/ml的顺铂,5μmol/ml TAT-OSBPMKK6(E)单用或者联合处理耐顺铂卵巢癌24h后,LC3-I逐渐向LC3-II转化,联合组LC3-II蛋白浓度最高,而自噬流发生的标志性蛋白P62的表达则逐渐减弱。7.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)诱导耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP细胞自噬性细胞死亡当氯喹(chloroquine,CQ)和TAT-OSBP-MKK6(E)联用处理细胞后,LC3-II及P62的聚集较分别用TAT-OSBP-MKK6(E)单用时明显增加,表明CQ可以有效地阻断自噬,引起自噬溶酶体内蛋白质的不断堆积。MTT法的结果进一步显示,自噬的抑制使TAT-OSBP-MKK6(E)对SKOV3/DDP细胞的抑制明显下降。8.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)通过激活P38MAPK通路诱导自噬增敏顺铂的抗肿瘤作用SB203580作用使P38蛋白表达下降,P38蛋白表达下降后,TAT-OSBP-MKK6(E)诱导的LC3-I向LC3-II的转化被显著地抑制。进一步应用MTT法检测不同处理组的细胞死亡数,结果显示,TAT-OSBP-MKK6(E)联合顺铂处理耐顺铂卵巢癌细胞SKOV3/DDP可以明显增加细胞死亡,P38MAPK信号通路的抑制明显阻断了这一增敏作用。结论融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)可以通过激活P38MAPK信号通路,诱导自噬性细胞死亡的发生,从而抑制人卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP细胞的增殖、侵袭和转移,增加其对顺铂的敏感性,一定程度上逆转顺铂耐药,表明融合蛋白TAT-OSBPMKK6(E)在卵巢癌顺铂耐药的治疗方面有望成为一种新型的化疗增敏剂,为卵巢癌耐药的治疗提供新的治疗模式。