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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种重要的动物病原菌,是引起猪传染性胸膜肺炎的主要病原,给集约化养猪业造成巨大的经济损失。猪传染性胸膜肺炎是一种重要的呼吸道传染病,以纤维素性出血性和坏死性胸膜肺炎为特征,可以导致所有年龄段的猪只发生感染。根据细菌表面多糖特别是荚膜多糖的差异,胸膜肺炎放线杆菌可以分为18个血清型。随着90年代规模化养殖业的迅猛发展,该病严重爆发并且迅速流行。该病自1957年由Pattison等首次报道以来,目前已广泛分布于瑞士、丹麦、美国等全世界大多数养猪国家,给现代养猪业带来巨大威胁,被国际公认为危害全球养猪业的重要疫病之一。胸膜肺炎放线杆菌在侵入宿主过程中,会遭遇各种不利条件,因此需要转录调控系统来感知和应答环境信号。猪只感染急性胸膜肺炎后,体温急剧升高至42℃左右,APP仍然能够在高烧温度下生长繁殖,并引起大量猪只发病死亡,但其抵抗高烧温度的机制仍然未知。CpxAR双组份调控系统是革兰氏阴性菌中普遍存在的一种非常重要的双组份调控系统,主要功能是感知和应答包膜的变化,尤其是周质蛋白的错误折叠和聚集。课题组前期发现,CpxAR双组份对APP在高烧温度条件下生长有重要影响。本课题发现胸膜肺炎放线杆菌CpxAR双组份直接调控apfABCD和pilMNOPQ基因簇,证明胸膜肺炎放线杆菌IV菌毛是由apfABCD和pilMNOPQ基因簇编码合成,并发现CpxAR双组份抑制ApfA蛋白的表达,防止其发生聚集,促进APP抵抗高烧温度的能力。具体研究内容如下:1.预测菌毛相关基因参与CpxAR双组份调控APP抵抗高烧温度本实验室前期研究发现了CpxAR双组份对APP在高烧温度(42°C)下生长有重要影响。本研究利用转录组学技术(RNA-seq),分析了在37°C和42°C条件下培养的野生株S4074和?cpxAR缺失株的差异表达基因,探索了CpxAR双组份调控APP抵抗高烧温度的机制。随机选取在37°C和42°C条件下受CpxAR调控的9个差异表达基因,用qPCR证明RNA-seq结果可靠。测序结果显示,在37°C条件下培养,有73个差异表达基因,其中52个表达上调,21个表达下调;在42°C条件下培养,有54个差异表达基因,其中41个表达上调,13个表达下调。对差异表达基因进行分析,筛选出可能参与CpxAR双组份调控APP抵抗高烧温度机制的10个基因,而且基因的转录水平都是显著上调。这10个基因分别是IV菌毛基因apfA、apfB、apfC和apfD,预测编码IV菌毛蛋白的基因pilM、pilN、pilO、pilP和pilQ,以及卷曲菌毛残余基因csgG。2.胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛由apfABCD和pilMNOPQ基因簇编码合成本研究利用生物信息学方法比对分析,预测基因pilM、pilN、pilO、pilP和pilQ可能参与编码合成胸膜肺炎放线杆菌IV菌毛。通过RT-PCR实验,证明基因pilM、pilN、pilO、pilP和pilQ组成一个五基因操纵子pilMNOPQ。测序分析结果显示,在APP的15个血清型中,组成apfABCD和pilMNOPQ操纵子的9个基因都是非常保守的。运用同源重组的方法,构建这9个基因的缺失突变株。用透射电镜观察突变株和野生株的菌毛生成情况,发现这9个基因都影响APP菌毛的形成。比较突变株和野生株的生物被膜形成能力和对细胞黏附能力,发现这9个基因都影响APP生物被膜形成和细胞黏附能力。这些结果显示,组成的apfABCD和pilMNOPQ操纵子的9个基因都参与APP的IV菌毛合成。3.CpxAR双组份抑制菌毛蛋白ApfA的表达,防止其聚集,促进APP抵抗高烧温度基于RNA-seq分析,筛选出10个可能参与CpxAR双组份调控APP抵抗高烧温度的基因,但是需要进一步的验证。我们首先通过同源重组的方法,在?cpxAR缺失株基础上分别缺失这10个基因,构建了10个双基因缺菌株。比较突变株和野生菌株在37°C和42°C条件下的生长能力,发现apfA基因是影响APP抵抗高烧温度的关键基因。共聚焦显微镜观察和流式细胞术分析实验再次证明了结果的可靠性。通过Western blot实验和MALDI-TOF质谱分析,证明ApfA蛋白是胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛的主要结构蛋白。运用Western blot实验,分析ApfA蛋白在野生株和缺失株的细胞表面和全菌中的表达情况。运用透射电子显微镜,观察野生株和缺失株的菌毛形成情况。这些结果表明?cpxAR缺失株抵抗高烧温度能力下降,是因为大量表达的ApfA蛋白在周质中发生聚集,无法分泌到胞外,参与组装IV型菌毛,导致细菌死亡。通过分析apf和pil基因簇,以及csgG基因的启动子区域,预测都含有CpxR的结合位点。并通过EMSA实验,证明CpxR可以直接结合apf和pil基因簇,以及csgG基因的启动子区域。运用DNase I足迹法,进一步证明CpxR可以直接结合apfA基因的启动子区域,并鉴定出CpxR的结合位点。通过Capping RACE方法,鉴定出apfA基因的转录起始位点。综上所述,我们的结果阐述了CpxAR双组份通过直接抑制IV型菌毛主要蛋白ApfA的表达,防止其发生聚集,促进APP抵抗高烧温度的分子机制。