背景食管癌（Esophageal cancer，EC）的发病率和死亡率分别位居全球肿瘤发病率和死亡率的第八位和第六位，中国每年新确诊的EC患者约占全球所有EC的一半。在中国，食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是EC主要的组织学类型，约占全部EC的90％。近年来，尽管ESCC的诊断和治疗手段已取得了显著进展，其5年整体生存率仍没有明显改善，约为15-25％；然而，及时治疗的早期ESCC患者的5年整体生存率可达90％以上。在中国，大部分确诊的ESCC已发展至中晚期，癌细胞已经远处转移和缺乏有效的治疗手段导致大多数ESCC患者在临床上确诊之后的生存时间不超过一年，其中60-70%的患者死于全身播散和转移。ESCC的发生发展是一个多病因、多步骤、涉及多分子的复杂动态演变过程，尽管前期研究已鉴定了许多与ESCC相关的分子改变，但是目前仍缺乏ESCC相关的特异分子改变，尤其是能够用于高危人群监测、早期诊断及预后评估的生物标志物分子。14-3-3σ，又称为HME-1（Human mammary-epithelim-specific marker1或stratifin），是一新的候选肿瘤抑制基因。在14-3-3蛋白家族中，14-3-3σ与肿瘤的相关性最为密切。14-3-3σ低表达见于乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、头颈部肿瘤等；但是，14-3-3σ的高表达也见于胰腺癌、结直肠癌、头颈部肿瘤、肺癌等，并且是预后评估的重要分子标志物之一。关于14-3-3σ与ESCC的相关性，目前国内外报道较少。14-3-3σ的差异表达可能是ESCC多阶段演进过程中的特征性分子变化之一，可能参与了ESCC多阶段演进过程，是ESCC预后的分子标志物之一。目的分析正常食管黏膜（Normal esophageal epithelium，NEE）、低级别上皮内瘤变（Lowgrade intraepithelial neoplasia，LGIN）、高级别上皮内瘤变（High grade intraepithelialneoplasia，HGIN）、不同临床分期ESCC中14-3-3σ表达的特征及规律，确定14-3-3σ表达变化与ESCC临床病理特征相关性，评价14-3-3σ在ESCC术后生存期中的预警作用，明确14-3-3σ在ESCC多阶段演进及恶性进展过程中的作用，为进一步明晰ESCC多分子、多阶段演进的分子机制奠定理论基础。1材料与方法1.1研究对象80例冻存的TNMⅠ-Ⅳ期ESCC及切缘组织（每期20例）标本来自林州市肿瘤医院；50例冻存食管黏膜活检组织样本（NEE20例，LGIN17例，HGIN13例）来自河南大学淮河医院；110例固定的食管黏膜活检组织样本分别来自河南大学淮河医院和林州市肿瘤医院；168例5年随访的ESCC术后患者，其中82例ESCC患者于2003-2008年在河南大学淮河医院接受根治性手术治疗，另86例来自上海芯超生物科技有限公司ESCC组织芯片（于2006-2008年接受根治性手术治疗）。食管黏膜上皮永生化细胞NEC、EC细胞系EC1、EC109、EC9706，及EC9706顺铂耐药细胞系EC9706/CDDP和紫杉醇耐药细胞系EC9706/PTX均用含10%胎牛血清RPMI1640于37℃、5%CO2条件下培养。1.2实验方法1.2.1Western blot方法应用2D裂解液（8M urea、4%CHAPS、40mM DTT、蛋白酶抑制剂）提取冰冻组织（20例NEE、17例LGIN、13例HGIN）、80例ESCC（TNMⅠ-Ⅳ期）及各细胞系（NEC、EC1、EC109、EC9706、EC9706/CDDP、EC9706/PTX）细胞蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。40μg蛋白进行12%SDS-PAGE电泳分离后电转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭非特异性的结合反应，鼠源的抗人14-3-3σ抗体（1：5000）4℃过夜孵育，HRP标记抗鼠二抗室温孵育1h，ECL检测目的条带；其后检测β-actin的表达。应用Bio-Rad的Quantity One进行蛋白条带的半定量分析。1.2.2免疫组织化学方法应用免疫组织化学方法（Immunohistochemistry, IHC）分析110例活检组织(包括41例NEE、37例LGIN、32例HGIN)和168例随访ESCC组织中14-3-3σ表达。IHC分析采用卵白素-生物素-辣根过氧化物酶复合物(ABC)法。1.2.3IHC结果半定量分析染色强度分为3级（无染色为0，弱阳性为1，中度阳性为2，强阳性为3），免疫阳性细胞百分数分为4级（阳性细胞数<10%为0，10–25%为1，26-50%为2，51-75%为3，76–100%为4），最终的综合评分为染色强度和免疫阳性细胞数评分之积（0-12分)。免疫评分≤6为低表达，>6为高表达。1.3SVM模型的建立及分类准确率应用Matlab软件进行SVM运算，将随访资料完整的168例ESCC随机分为128例训练集和40例测试集，将训练集128例ESCC所有属性进行各种组合建立最优ESCC预后分类模型，测试集40例ESCC检验该分类模型对ESCC术后生存期预测的准确性。1.4统计学分析所有统计分析均采用SPSS17.0软件。数据表示为平均值±标准偏差（SD）。Westernblot所得蛋白条带采用Mann-Whitney测试或Wilcoxon符号秩检验的统计方法。生存曲线采用Kaplan-Meier法估计，曲线之间的差异用log-rank检验测试。各临床因素对预后生存的影响采用Cox回归模型的分析方法。受试者工作特征（ROC）的曲线下面积(AUC)分析来评估各临床病理特征和SVM分类器的预测效能。卡方检验或四格表精确检验来评价14-3-3σ表达与临床病理特征之间的关系，Gamma test分析14-3-3σ与ESCC演进的相关性。检验水准为P值小于0.05。2结果2.1从NEE发展至LGIN、HGIN、ESCC，14-3-3σ白表达逐渐降低，ESCC中14-3-3σ蛋白表达最低；Gamma检验分析表明14-3-3σ蛋白表达与ESCC癌前病变进展呈负相关（Gamma value=-6.163, P=0.000），14-3-3σ表达在NEE vs HGIN，NEE vs ESCC，LGINvs ESCC间的表达差异显著（P＜0.05）；Western blot结果表明：与癌旁非癌食管黏膜组织相比，TNMⅠ-Ⅳ ESCC中14-3-3σ表达显著降低，并且随TNM分期进展，14-3-3σ表达依次降低；2.2NEC细胞未检测到14-3-3σ蛋白的表达，而EC1、EC109、EC9706细胞中均检测到中等程度的14-3-3σ蛋白表达，耐药细胞EC9706/PTX和EC9706/CDDP的14-3-3σ表达最高；2.3IHC结果表明14-3-3σ蛋白主要位于细胞质和细胞膜，卡方检验分析结果表明14-3-3σ表达与ESCC分化程度呈负相关（P＜0.05）；而与ESCC患者性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润深度无显著相关性（P＞0.05）；2.4Kaplan-Meier生存分析表明：14-3-3σ表达降低与ESCC预后不良显著相关（P＜0.05），14-3-3σ高表达及低表达ESCC患者的5年整体生存期分别为43.47%、25.62%（log-rank test, χ2=8.448, P=0.004）；2.5Cox多因素比例风险回归模型分析表明：T分期和14-3-3σ是影响ESCC预后的独立因素（P <0.05）；2.6应用SVM建立的ESCC预后SVM分类模型（ESCC-SVM）的最优属性包含性别、年龄、T分期、分化程度、淋巴结转移、TNM分期、14-3-3σ，其预测的ESCC生存期的效能明显优于其他各临床病理特征。3结论3.114-3-3σ蛋白表达异常发生于ESCC病变的早期阶段，尤其是HGIN，提示14-3-3σ可能成为ESCC早期诊断的分子标志物；3.214-3-3σ蛋白表达与ESCC患者预后不良呈负相关，并且是影响ESCC预后的独立危险因素，提示14-3-3σ可能成为ESCC预后评估的分子标志物；3.3本研究建立的ESCC预后预测模型ESCC-SVM能够有效的预测ESCC术后生存期，为ESCC患者术后的个体化治疗提供了实验室依据。