苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)合成的杀虫晶体蛋白和用Bt基因改造的转基因植物对多种害虫具有特异性毒杀作用,是环境友好型生物农药,因此被广泛地用于防治农业和卫生害虫。杀虫晶体蛋白进入昆虫的中肠被消化酶转化为活性分子,与昆虫中肠细胞膜上的高亲和性特异受体结合后插入细胞膜造成细胞膜穿孔,破坏细胞内外的渗透平衡。大量水分子进入细胞,造成细胞肿胀、破裂,导致中肠溃烂,从而使害虫死亡；另一部分没有被毒素直接杀死的昆虫,一段时间后也会因细菌感染死亡。Bt毒素在昆虫中肠pH=9.5的碱性环境下才能发挥作用,因此,该毒素被认为对哺乳动物基本无毒杀作用。随着大量转Bt基因植物直接或间接地进入人类的食物链后,针对Bt毒素的环境及食物安全性评价成为转基因领域中一个新的研究热点。围绕Bt毒素安全检测监控评价技术已经取得了显著的进展。生物测定法、免疫检测法(包括协同凝集反应、酶联免疫吸附、Western-blot、试纸条法、蛋白生物芯片等)、核酸检测法、仪器检测法(包括流式细胞仪、电泳、质谱等)均有研究报道,上述方法在毒素的毒力鉴定和安全检测中发挥了较好作用。但是,目前的方法中,有些方法的技术研发耗时长、费用高；有些与分子机制联系不紧、应用过程影响因素多；有些则存在仪器昂贵及对操作专业人员要求高等问题。抗体检测技术是近年来在医学以及农业技术领域快速发展的一种蛋白分析技术,具有快速、灵敏、方便、易普及的优点,在Bt毒素蛋白快速检测技术领域具有较好的应用前景。基因工程抗体是指继多克隆抗体和单克隆抗体之后第三代通过基因工程技术制备出的多种新型抗体,其优点是制备快速、成本低、产量大,为抗体检测技术提供了高质量的抗体。单链抗体(single chain variable fragment, scFv)是一种小分子基因工程抗体,由于低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点被广泛应用于医学诊断、治疗的研究,而目前国内外利用针对Bt毒素scFv进行免疫检测的研究鲜见报道。在此背景下,本论文利用噬菌体抗体库技术对两种Bt毒素进行亲和淘选获得单链抗体,模拟其三维结构,并以Cry1Ac为对象建立了多种基于单链抗体的免疫检测方法,将基因工程抗体应用于转基因和生物农药检测及植物保护研究领域,拓宽了其应用范围,促进了免疫分析技术在食品安全领域的发展。同时单链抗体与CrylAc结合模型也为单链抗体亲和力成熟及Bt与受体的识别机制等研究提供了参考。本研究主要包括了以下几个方面：1.构建了天然鼠源单链抗体噬菌体展示库用Trizol试剂提取未经免疫的Balb/c小鼠脾脏总RNA。利用重链可变区和轻链可变区通用引物通过RT-PCR的方法扩增VH和VL基因,并通过SOE-PCR将两个可变区基因通过连接肽连接,将拼接成功的重组噬菌粒,电转化到感受态细胞中大量增殖,经辅助噬菌体超感染,构建了库容为2.04×107的天然噬菌体抗体库。利用该抗体库筛选到的抗-Bt单链抗体亲和力较低,因此确立Tomlinson.库为筛选库源。2.建立了抗-Bt毒素单链抗体筛选及检验体系并获得了较高亲和力的单链抗体以Cry1C和CrylAc为对象,建立了基于噬菌体抗体库淘选、展示及鉴定的技术体系。选用人源Tomlinson抗体库为筛选库,主要采用胰蛋白酶洗脱方式,经过四轮筛选和阳性克隆富集的过程,完成单克隆测序鉴定与ELISA检测验证。抗-Cry1C的单链抗体筛选制备结果显示：竞争洗脱与胰蛋白酶处理联用的洗脱方法可以使富集率大幅提高。对表达稳定的1C6克隆进行可溶性表达,结果表明在30℃条件下添加1mM的IPTG诱导表达16h可以达到最大表达量。对1C6表达产物进行亲和纯化后用非竞争ELISA法测得亲和常数为(5.8+0.5)×106M-1。抗-CrylAc的单链抗体筛选制备结果显示：经过四轮亲和淘选后,有一株阳性克隆大量富集,命名为1AC6,此单链抗体在诱导物IPTG浓度为0.8nM时,25℃诱导表达18h表达量最大。1AC6经亲和纯化后测得亲和常数为(3.33±0.05)×107M-1。利用计算机模拟技术,完成了1AC6和CrylAc的分子对接模型,结果显示重链的3个CDR区和轻链的CDR3区参与了与抗原的结合。1AC6的结合区域中有部分氨基酸与氨肽醇受体相似,该结果对进一步开展抗体亲和力成熟和受体结合机制等研究具有参考价值。3.完成了Bt毒素抗体检测技术构建与验证测试可溶性1C6单链抗体建立的间接ELISA检测方法结果显示：该方法的线性范围在0.023-4.35μg/mL之间(IC80-IC20)。米粉中Cry1C的添加回收实验结果表明其回收率在89.8%到97.2%之间,变异系数小于5.0%。优于国内报道的检测限为400ng/mL兔源多抗。因此该方法有望运用于检测食品和环境样品中的CrylC毒素。抗-CrylAc多克隆抗体建立的时间分辨荧光免疫方法结果显示：该方法的最低检测限为0.3ng/mL,优于间接ELISA的检测方法,且检测时间比ELISA明显缩短。在实际样本测试中,黑土、黄壤、红壤、紫色土、潮土5种土壤中Cry1Ac毒素的平均回收率为75.03%,并且随着不同土壤中有机质含量的降低,Cry1Ac毒素蛋白的回收率逐渐升高,该现象对于土壤中Bt吸附的研究有一定的指导意义。基于融合型1AC6建立的免疫-PCR结果显示：该技术的灵敏度优于单一使用ELISA法检测,辅助荧光检测法检测限可以达到0.2ng/mL,而间接ELISA为40ng/mL。引入噬菌体抗体较好地解决了传统免疫-PCR技术中报告DNA分子的选择、用量及标记方法等干扰实验结果的问题。基于可溶性1AC6建立的双抗夹心ELISA结果显示：以1AC6为包被抗体,多克隆抗体为检测抗体,确定双抗夹心法工作浓度：1AC6浓度为2.5μg/mL,酶标抗体1600倍稀释时,对靶标抗原CrylAc的检测限为14ng/mL。单克隆抗体建立的此方法检测限优于单链抗体,因此后续需要利用体外亲和力成熟的方法对1AC6进行改造。基于可溶性1AC6建立的胶体金免疫层析法结果显示：用1AC6制备金标抗体,其最适稳定标记量为20μg/mL。通过结果判定,该快速检测试纸条对CrylAc的检测限为58ng/mL,可以对转基因棉花种子进行定性检测。利用1AC6单链抗体,建立的免疫-PCR、双抗夹心ELISA与胶体金免疫层析三种检测方法,在样本检测要求中均具有较好的实用价值。