红耳龟(Trachemys scripta elegans)是世界最危险的100个入侵物种之一,是典型的外来有害物种,现已证实红耳龟能在我国台湾、海南、广东等地的野外成功繁殖,其繁殖力、存活率远大于我国本土龟类。由于红耳龟生性活泼、色彩艳丽、极易饲养等特性倍受养殖户青睐。2009年,国内养殖场年产量超过5000万只,每年从国外进口的量约800万只,并销售到国内外各市场。如此庞大的养殖规模,运输和管理过程中因疏漏导致的逃逸现象在所难免,更为严重的是红耳龟成为大多数人选择放生的对象。由于宠物丢弃、宗教放生、养殖逃逸,甚至执法人员误把红耳龟当成保护物种放生等各种因素,导致红耳龟在我国野外广泛存在,对我国自然生态系统将产生严重影响。令人担忧的是到目前为止这种状况不但没有改观,还有发展的趋势。如何有效控制红耳龟在入侵地的蔓延,国内外对该物种有效防治方法的研究尚未见报道,因此,对其防治方法开展研究十分必要。基于不育防治技术在虫害和鼠害方面取得的巨大成功,我们提出将不育防治技术应用于外来物种红耳龟的防控,从生态学、生物学角度考虑,不育防治技术是一项治本的措施。通过对养殖场出售的红耳龟个体进行售前的不育处理,将有效阻止逃逸、放生个体参与野外种群的繁殖,并可能干预野外可育个体的繁殖,从而起到有效控制该物种在野外迅速蔓延的态势。经过对大量有关不育剂资料的查阅筛选及预实验,本研究以不育剂膦氧氮丙啶(MAPO)对雄性红耳龟的不育效应为主题,采用腹腔注射的方法,1)通过检测脏器系数、睾丸体积,石蜡组织切片及图像处理软件(Motic Images Advanced3.2)测量曲细精管等,研究MAPO影响雄性红耳龟生殖功能的有效性;2)通过双抗体一步夹心法酶联免疫(ELISA)检测激素、抗氧化酶、标志酶的变化,初步探讨其不育作用机制;3)在产精期,通过检测红耳龟的睾丸、附睾脏器系数、激素以及制作组织切片,研究其不育可逆性。以期探寻野外红耳龟的防治新途径,为外来物种红耳龟的防治提供科学依据。主要研究结果如下:1、MAPO对雄性红耳龟不育效应研究选用健康、成体雄性红耳龟(BW:738.9±101.2g,n=160)进行实验,随机均分为4组,即对照组、低、中、高剂量组,每组40只。根据预实验,采用腹腔注射法,低、中、高剂量组每次分别注射2ml浓度为0.1g/L、3g/L、10g/L的MAPO盐溶液,对照组则注射同等剂量的0.65%生理盐水,每3天注射一次,共处理15d。一般体征观察:低、中剂量组红耳龟行动敏捷,健康活泼,平均摄食量与对照组基本一致,存活率为100%。高剂量组平均摄食量下降,处理前后体重无明显变化,但存活率为0%。这表明中剂量(3g/l,15d)及以下处理对雄性红耳龟生长无影响,而高剂量组(10g/l,15d)剂量高于成体雄性红耳龟的最大耐受剂量(ld0),导致高剂量组个体死亡,建议进一步扩大试验,做半致死剂量(ld50)测试。与对照组相比,各处理组附睾、肾脏、肝脏、心脏脏器系数均无明显差异。低剂量组睾丸脏器系数(0.17±0.07)和体积(4.63±0.52ml)与对照组无显著差异,中、高剂量组睾丸脏器系数(0.06±0.02、0.08±0.03)则明显低于对照组(0.15±0.07),其体积(1.83±0.18ml、2.01±0.54ml)也显著低于对照组(4.22±0.73ml),约为对照组的1/2,提示睾丸是mapo对雄性红耳龟作用的效应器官。经组织病理学观察发现,各处理组附睾、肾脏并未发生病变,唯高剂量组肝脏组织略有空泡化。对照组曲细精管中生精上皮排列有序,由外向内依次可见精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞,生精上皮厚度为(80.46±6.87μm)。低剂量组生精上皮排列松散,次级精母细胞及精子细胞脱落进入管腔,生精上皮厚度为(71.60±21.61μm),与对照组无显著差异,表明低剂量(0.1g/l,15d)对雄性红耳龟无显著的不育效应。而中、高剂量组生殖细胞层数减少变薄,几乎全部退化,生精上皮厚度分别为(9.67±8.67)μm和(4.30±2.29)μm,约为对照组的1/10和1/20,与对照组相比差异显著,仅见一层支持细胞靠近基底膜,间质细胞发育良好,偶见集群增生,表明mapo对雄性红耳龟具有明显的不育效应,它能穿透血—睾屏障,损坏各级生殖细胞,阻碍精子的产生,引起不育。2、mapo对雄性红耳龟不育作用机制初步研究与对照组相比,各处理组血清和睾丸中促性腺激素(fsh、lh、prl)、性激素(t、e)含量均无显著差异,表明mapo对雄性红耳龟生殖调节系统下丘脑—垂体—性腺轴(hpt)无影响,推测mapo对雄性红耳龟的正常发情及性活动无影响。中、高剂量组睾丸标志酶ldh(4.71±0.10u/l、4.64±0.12u/l)、alp(142.87±1.99u/l、140.55±3.66u/l)显著低于对照组,ldhx(4.19±0.13u/l、4.16±0.06u/l)非常显著低于对照组(4.98±0.11u/l);抗氧化酶sod(88.65±3.02u/l、90.15±3.04u/l)显著低于对照组(102.08±3.57u/l),gsh-px(21.89±2.39u/l、20.66±2.09u/l)显著低于对照组(33.32±4.27u/l)。表明mapo破坏睾丸结构,引起生殖细胞抗氧化酶活性降低,核酸代谢紊乱,相应标志酶活力下降,能量代谢受阻,是其可能的部分作用机制。3、MAPO对雄性红耳龟不育可逆性研究停止注射30d,低剂量组睾丸脏器系数(0.18±0.02)和体积(1.14±0.13mL)与对照组大小基本一致。中剂量组睾丸脏器系数(0.07±0.02)明显小于对照组(0.17±0.04),睾丸体积(0.58±0.05mL)也显著小于对照组(1.52±0.51mL)。表明恢复30d时,中剂量组睾丸持续萎缩。组织病理学观察发现,对照组与低剂量组曲细精管中生精上皮排列着较多的各级生殖细胞,由基底膜向腔内依次排列着精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞、精子,管腔中精子数目较多,表明低剂量组具有正常的生精功能。而中剂量组曲细精管则空腔化,只存在支持细胞贴近基底膜。说明恢复30d时,中剂量组不育个体并未恢复生精能力。停药122d,低剂量组睾丸脏器系数(0.14±0.02)和体积(1.51±0.21mL)与对照组无明显差异,附睾脏器系数(0.06±0.01)与对照组也无显著差异。而中剂量组睾丸脏器系数(0.08±0.01)明显小于对照组(0.17±0.02),睾丸体积(0.66±0.07 mL)明显小于对照组(2.34±0.73 mL),附睾脏器系数(0.03±0.00)也显著低于对照组(0.07±0.01)。经组织病理学观察,对照组与低剂量组睾丸曲细精管结构完整,并产生一定数目的精子,而中剂量组曲细精管则持续空腔化,只有贴于基底膜的支持细胞,并无精子;对照组与低剂量组附睾中存有大量精子,中剂量组附睾则空腔化,无精子。表明恢复122d时,中剂量组(3g/L,15d)不育个体并未恢复生殖力,提示该处理浓度及处理时长可引起成体雄性红耳龟不可逆的生精功能障碍。综上可知,MAPO对雄性红耳龟具有明显的不育效应,能穿透血—睾屏障,引起生殖细胞抗氧化系统紊乱,抗氧化酶及标志酶活性降低,能量代谢受阻,损坏各级生殖细胞,阻碍精子产生,引起雄性红耳龟不可逆的生殖障碍。浓度为3g/L MAPO经腹腔注射处理15d既对其摄食量和体重无影响,又能引起不可逆的不育效应,是应用不育防治技术控制外来物种红耳龟的参考剂量。本论文首次提出将不育防治技术应用于外来物种红耳龟的防治,并首次研究了不育剂MAPO对爬行动物的不育效应,为红耳龟不育防治技术的进一步开发和利用奠定了理论基础,拓展了不育防治技术控制有害生物的应用范畴。