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柑橘霉病在柑橘产业中是造成经济损失的严重病害之一,可以造成采摘以后柑橘果实的霉变和腐烂,特别是在加工、贮藏和运输的过程中。三唑类化学农药的长期大规模应用导致了耐药菌株的出现,使得安全和对环境友好的真菌病害防治方法的开发更加迫切。真菌病毒是以真菌为寄主的一类病毒,已有研究报道部分具有弱毒效力的真菌病毒可削弱宿主致病力,可以作为防治植物真菌病害的新型手段。柑橘青霉菌中对于真菌病毒的报道尚属少数,因此筛选新的青霉病毒可以为控制柑橘青霉病提供新的思路。它们也可以为真菌病毒的起源与进化及其同寄主相互作用机制的探索提供了新的参考。本文以柑橘霉病的致病菌指状青霉和皮落青霉为研究材料,分离鉴定了两种新的柑橘青霉病毒,通过比较感染其中一种病毒菌株和无毒菌株的生长情况探究了该病毒的生防潜力。本文主要研究结果如下:1、武汉、重庆、信阳地区水果市场采集带有明显霉变的柑橘类水果,得到111个样品。经初筛和复筛,从橘皮表面筛选出131株柑橘青霉菌株。对筛选菌株进行初步的抗性鉴定、保种、提取基因组DNA。提取筛选菌株基因组DNA后进行电泳分析和部分菌株ITS鉴定。观察筛选菌株是否有游离于基因组之外的核酸条带,初步判断菌株是否感染病毒。随后选取有游离于基因组之外核酸条带的菌株进行dsRNA提取,分别经DNase I和S1 Nuclease酶解后核酸条带依然存在,说明游离的条带为dsRNA,确认携带真菌病毒的菌株。所有分离菌株中得到16株携带真菌病毒的柑橘青霉菌株,其中重庆(HS-CQ88～HS-CQ146)有6株,湖北(HS-Z1～HS-Z31)有6株,河南(HS-XY1～HS-XY21)有4株。没有筛选出新型病毒,所筛选出的病毒都在本实验室之前鉴定的柑橘青霉菌株中出现过。其中7株柑橘青霉菌携带的真菌病毒同之前实验室鉴定的指状青霉(Penicillium digitum)菌株HSPd-X7感染的为同一种病毒。2、在实验室之前筛选和纯化的指状青霉菌株Pd-X7中观察到两条大小在1500bp～2000bp 之间的 dsRNA 条带;将两条 dsRNA(dsRNA1 和 dsRNA2)进行反转克隆后测序分析表明dsRNA1全长为1753bp,dsRNA2全长为1580bp。开放阅读框预测表明dsRNA1和dsRNA2各包含一个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF);NCBI blast分析结果表明dsRNA1编码RNA依赖性RNA聚合酶(539aa,62.3kDa),dsRNA2编码外壳蛋白(434aa,46.4kDa)。对其分别进行同源序列比对和进化树构建结果都显示该病毒属于二分病毒科Gammapartitivirus属。真菌病毒PdGV1的CP和RdRp分别同二分病毒科Gammapartitivirus属成员Penicillium stoloniferum virus S(PsV-S)的 CP 和 RdRp 高度相似。PdGV1 和 PsV-S 在 UTR以及ORF编码区的长度有较明显的区别。PdGV1 dsRNA的5’非编码区(UTR)序列同其他的gammapartitiviruses—样有特征序列;3 ’ UTR和其他的gammapartitiviruses 一样没有poly(A)尾和保守的序列。从序列的二级结构来看,PdGV1和PsV-S的UTR序列二级结构和ORF的氨基酸序列二级结构都存在着较大差异。病毒PdGV1的RdRp与PsV-S的RdRp序列相似度最高为93%,CP序列相似度80%。鉴于病毒物种划分标准,在CP氨基酸序列相似度小于或等于80%的情况下可以判定为新的病毒种,因此PdGV1可区别于PsV-S作为一个新的病毒种。同之前报道的二分病毒科成员一样,PdGV1的RdRp氨基酸序列拥有6个保守结构域。通过超速离心方法获得病毒粒子粗提液,然后进行蔗糖密度梯度离心,纯化病毒粒子。将病毒粒子样品用PTA负染后用透射电镜观察,该病毒粒子的直径约29nm,符合在二分病毒科Gammapartitivirus属成员粒子的形态特征。综合以上特征对该病毒命名为 Penicillium digitum Gammapartitivirus 1(PdGV1)。3、比较感染PdGV1菌株Pd-X7和本实验室之前筛选鉴定的菌株HSPd-F10的生长速度,Pd-X7自身生长速度和菌株Pd-F10相比相差无几。多次尝试对Pd-X7进行脱毒处理,无法得到无毒菌株。将PdGV1病毒粒子对Pd-F10进行转染获得感染病毒菌株Pd-F10V。比较二者生长速率,测定得到Pd-F10在PDA平皿上的菌落面积为37.8cm2,相应Pd-F10V的菌落面积为34.5cm2。结果表明Pd-F10和Pd-F10V的生长速度并没有很大差异,真菌病毒PdGV1对宿主真菌的生长状态并未产生显著影响,这与之前的研究中双分病毒科对宿主性状几乎没有影响的结果是一致的。4、利用高通量技术对柑橘皮落青霉(Penicillium crustosum)菌株HSPc-CQ15中的dsRNA1-5进行测序,对获得的序列分析表明其中dsRNA5属于一种新的ssRNA病毒基因组,其长度为2885bp。NCBI blast分析表明此dsRNA编码的蛋白与ssRNA病毒Wilkie narna-like virus 2相应的RdRp相似度最高,将其命名为Penicillium crustosum Narna-like virus 1(PcNLV1)。PcNLV1 的 dsRNA 经预测有一个编码蛋白的ORF,比对表明其编码RdRp(797aa,91.7kDa)。dsRNA5的5’末端非编码区长度为243bp,而3’末端非编码区长248bp,均能够形成稳定的茎环结构。将PcNLV1编码的RdRp同与blast分析显示亲缘关系最近的narna-like virus和narnavirus进行氨基酸序同源序列比对,结果显示PcNLV1同nama-like virus有较高同源性,拥有几个保守的结构域,而同narnavirus同源性较低。由此可以推断PcNLV1同几个Narna-like virus在进化关系上更相近。将PcNLV1的RdRp与dsRNA病毒,包括裸露核糖体病毒科(Narnaviridae)的Narnavirus属病毒同几个Narna-like virus病毒所编码的RdRp—起构建进化树表明PcNLV1与Narna-like virus聚在一起,属于未分类的病毒科属。