论文部分内容阅读
肿节风药材资源独特,在全球仅有亚洲南部和东亚有分布,在中国广泛分布于长江以南地区,也属于岭南地区一种特色全草类中药材,其资源丰富,且分布较广,生命力强,可人工种植,具有很大的市场及药用潜在价值。研究发现肿节风具有抗流感病毒活性,从肿节风中提取分离出的刺木骨苷B1和迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷（迷迭香酸苷）经实验证明均具有体外的抗流感病毒作用,本论文在此基础上,对不同产地来源肿节风药材及其不同药用部位进行多指标质量控制,根据不同部位中各化合物的含量分布情况,将刺木骨苷B1及迷迭香酸苷作为一个新的抗流感病毒活性部位进行提取制备,为后续药效学研究及开发新的抗病毒制剂奠定基础,也为开发新的肿节风标准品制备及其整体质控提供参考。目的:采用分子生物学手段对所采集的不同产地肿节风新鲜药材进行鉴定,确定所采集样品基原的准确性;采用HPLC法对肿节风及其不同药用部位中绿原酸、刺木骨苷B1、异嗪皮啶、迷迭香酸苷、迷迭香酸进行含量测定,对不同产地来源肿节风药材进行多指标成分质量评价,说明不同部位中各化合物的含量分布情况;对肿节风根茎中有显著抗流感作用的活性部位进行提取及纯化工艺的研究,为后续药效学研究及开发新的抗流感病毒制剂提供药学研究基础。方法:1.分别采集广东、广西、福建、湖南、四川不同地区肿节风新鲜药材,预处理后,取叶片采用本研究室改良的CTAB法进行DNA的提取,0.1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行PCR反应,送北京擎科生物技术有限公司进行ITS序列的检测,采用Genestudio软件进行序列拼接校对,并用MEGA 6软件对10个肿节风样品进行序列比对及分析,构建Neighbor-joining系统进化树。2.选择肿节风药材中绿原酸、刺木骨苷B1、异嗪皮啶、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷（迷迭香酸苷）、迷迭香酸为检测指标建立HPLC检测方法。对HPLC分析方法进行方法学验证,包括:线性及范围、精密度、重复性、稳定性、加样回收率。3.不同产地来源肿节风药材及其根、茎、叶中主要化合物含量差异:采集及广东、广西、湖南、四川不同地区的10批肿节风药材,HPLC法检测肿节风及其不同药用部位中5个指标性性成分的含量,比较不同产地来源肿节风全株及其根、茎、叶化学成分含量差异及同一产地肿节风根、茎、叶中各指标性成分含量差异。4.选取肿节风根和茎作为提取药材,对肿节风根和茎中刺木骨苷B1及迷迭香酸苷部位进行提取纯化研究。通过单因素实验,确定了最佳提取工艺后,利用D101大孔树脂在正交实验的基础上进行纯化工艺研究。5.选取刺木骨苷B1含量较高的肿节风根作为提取药材,按照优选的抗病毒有效部位提取工艺进行提取,再利用大孔树脂柱层析对提取液进行分离纯化后,利用制备液相色谱仪对纯化后流分进行精制纯化,HPLC峰面积归一法计算纯度。结果:1.本研究所采集的广东、广西、福建、湖南四个省份10个不同批次实验样品通过植物分子学手段进行,其基原基原均属于Sarcandra glabra,说明所采集样品均为肿节风药材。2.建立HPLC法在同一波长下检测肿节风中5个指标性成分的方法,5个指标性成分峰形及分离度均较好,精密度及稳定性试验检测峰面积的RSD均﹤3%,重复性中各化合物含量的RSD﹤2%,平均加样回收率也达到98%102%。3.对不同产地来源肿节风全株及其根、茎、叶样品进行HPLC含量测定,结果:（1）不同产地来源肿节风同一药用部位中（全株、根、茎、叶）5个化学成分及其总含量含量均有所差异,总体来看,迷迭香酸和迷迭香酸苷含量差异为最大,如广东韶关始兴种植肿节风全株中迷迭香酸含量是湖南永州道县野生肿节风的10倍左右;广东韶关韶关始兴种植肿节风茎中迷迭香酸苷及迷迭香酸的含量是广西玉林容县野生肿节风茎的15倍左右;广西瑶族自治区富川县种植肿节风叶中迷迭香酸的含量约是湖南永州道县野生肿节风叶的30倍之高。（2）同一产地肿节风药材不同药用部位中各化合物含量分布差异较大,综合比较,其中根中刺木骨苷B1含量高于其它部位,茎中迷迭香酸苷的含量高于其它部位,而叶中迷迭香酸的含量高于其它部位。4.肿节风根和茎最优提取工艺为:肿节风根和茎药材粗粉,加入15倍量50%乙醇超声提取两次,每次1h,合并滤液,减压浓缩至一定体积;最优纯化方式为:取预处理后的D101型大孔树脂柱,湿法装柱,柱径比为1:5,待水流干后,开始上样,上样量与树脂柱体积比为2:1,上样肿节风根茎提取液浓度为0.1g×mL-1,上样流速为2.5h×BV-1,达到吸附平衡后,先用3倍柱体积的去离子水洗脱,再用3倍柱体积25%乙醇进行洗脱,洗脱流速为2.5h×BV-1,接收第1倍柱体积的后面1/3流分（10 mL）,第3个柱体积的前面1/3流分（10 mL）,再与第二个柱体积接收流分合并。5.经过大孔树脂分离纯化后,纯度较高洗脱流分中刺木骨苷的含量可达到70%90%,将这些流分合并浓缩后制备液相纯化精制后,HPLC检测,刺木骨苷的纯度可达到98%以上,可作为制备标准品方法用于肿节风定量质控研究。结论:1.利用实验室改良的CTAB法,用分子生物学手段对肿节风药材进行鉴定,10批肿节风药材的ITS2序列一致,说明所采集药材基原均属于Sarcandra glabra,基原不是引起肿节风成分含量差异大原因。2.由不同产地来源肿节风全株及其不同药用部位中主要化学成分含量差异分析可知,引起各化合物差异较大的主要原因为肿节风药材的来源是种植药还是野生,且总体来看种植肿节风药材中各化合物含量及其总含量高于野生药材。由同一产地肿节风药材及其不同药用部位主要化学成分含量差异分析可知,具有抗流感病毒作用的刺木骨苷B1及迷迭香酸苷主要集中在肿节风的根和茎中,所以在后续肿节风刺木骨苷及迷迭香酸苷部位的提取分离纯化实验中应去掉杂质和色素含量较多的叶,以肿节风根和茎作为提取药材。3.对肿节风根和茎中具有抗流感病毒作用的刺木骨苷B1及迷迭香酸苷活性部位进行提取纯化后,最终有效部位中刺木骨苷B1及迷迭香酸苷的含量分别为0.250,0.043g×mL-1,部位纯度峰面积归一化法计算可达到70%左右且该工艺简单稳定、成本低廉,可用于肿节风中抗病毒部位的富集制备及进一步开发利用。4.肿节风根中刺木骨苷标准品的制备工艺简单,稳定,分离纯化效果明显,可得到较高纯度刺木骨苷B1化合物,为肿节风新的含量测定标准品制备提供参考。