目的汉坦病毒(hantavirus，HV)属于布尼亚病毒科(bunyavirida)汉坦病毒属(genus hantavirus)，是引起急性病毒性传染病肾综合症出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)的病原体。目前，根据血清学及分子生物学方法汉坦病毒又可分为汉滩病毒、汉城病毒、普马拉病毒、希望山病毒等不同的型别，其中汉滩病毒、汉城病毒为我国最常见的两种病毒。研究表明，汉坦病毒的包膜糖蛋白(G1、G2)可以刺激机体产生中和抗体，对感染的动物和人起到保护作用，而糖蛋白的中和抗原位点主要位于G2上。本实验旨在以质粒pGEX-6P-1为载体，构建含有汉坦病毒76-118株M2基因的原核表达载体pGEX-6P-1／M2，并观察G2蛋白在原核细胞中的表达。方法一、融合蛋白表达载体pGEX-6P-1／M2的构建(一) M2基因的克隆以汉坦病毒76-118株M基因为模板进行PCR反应，扩增得到含完整编码汉坦病毒G2蛋白基因M2的1600bpDNA片段，凝胶回收后—20℃保存。(二)质粒pMD18／M2的构建将上述PCR产物与T载体pMD18分别经XhoⅠ和BamHⅠ消化后，在连接酶的作用下16℃连接约16h。连接产物10μl转化入感受态大肠杆菌DH5α，铺LB平板并加入氨卞青霉素，37℃培养16h；筛选阳性菌落扩增培养，以碱裂解法小量提取重组质粒后，储存于—20℃。(三)原核表达载体pGEX-6P-1／M2的构建将重组质粒及原核表达载体pGEX-6P-1均用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后在T4DNA连接酶作用下于16℃连接约16h。连接产物10μl转化入感受态大肠杆菌DH5α，铺LB平板并加入氨卞青霉素，37℃培养16h。二、重组质粒的转化、筛选及鉴定按常规方法，将连接后所得的重组子转化入感受态宿主菌E．coli BL-21，在含氨苄青霉素LB平板上铺板，37℃温箱过夜培养。第二天从平板上挑取菌落接种于含氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，37℃摇床震荡培养5h，快速碱裂解法粗提质粒，-20℃保存。三、重组蛋白GST-G2的诱导表达和纯化将含重组质粒pGEX-6P-1／M2的大肠杆菌BL-21接种于含Amp~+的LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。次日将过夜培养物转接于1000ml含Amp~+的LB培养基中，继续在37℃振荡培养约3h。加入IPTG至终浓度为0.1mmol／L，置37℃继续培养4h，离心，收集菌体。加细菌裂解缓冲液超声裂解细菌，离心取上清，对融合蛋白进行亲和层析纯化。四、SDS-PAGE电泳及Western-Blot分析取纯化后的蛋白产物进行SDS-PAGE电泳，1h后，取下凝胶进行转印，PVDF膜经TBS液洗涤10min后，封闭液封闭1h，再以TTBS洗涤两次。加入用1：200封闭液稀释的患者血清，4℃孵育过夜，经TBS、TTBS洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2h，TTBS、TBS洗涤，DAB显色。五、间接ELISA法检测融合蛋白活性以表达的融合蛋白为抗原，应用间接ELISA法检测50份HFRS阳性血清和10份正常人血清中抗汉坦病毒抗体，分析融合蛋白的生物活性。结果一、M2基因片段的扩增经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见一条约1600bp的特异性扩增区带，与预期结果一致。二、pMD18-M2重组质粒的酶切鉴定用EcoRV和BamHⅠ双酶切质粒，酶切产物经1％琼脂糖电泳证明重组质粒带有相应的目的基因。质粒由北京三博远志生物公司进行测序，将测序结果与GenBank中的M2核苷酸序列进行比较，同源性达98％，开放读码框正确。三、融合蛋白的诱导表达及纯化SDS-PAGE电泳结果可见与预期融合蛋白分子量大小相符的蛋白条带。Western-Blot分析进一步表明该蛋白条带为GST-G2融合蛋白。亲和层析纯化后，蛋白产量可达70％以上。四、间接ELISA法检测结果以融合蛋白为抗原，50份HFRS患者阳性血清抗体检测结果为47份，正常人血清抗体检测结果为阴性，表明融合蛋白具有同天然蛋白相似的生物学活性。结论1、本研究成功构建汉坦病毒M2基因原核表达载体pGEX-6P-1／M2；2、重组蛋白G2能够在原核细胞中进行有效的表达；3、纯化的重组蛋白G2具有生物学活性。