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癫痫是神经科的常见病,尽管新的抗癫痫药物不断出现,但是,仍有约20-30%的病人因其疗效不佳而成为难治性癫痫。深入研究癲痫形成机制,是寻求新型抗痫措施的前提。近年来,越来越多的证据提示5-HT参与各种实验性诱发癲痫发作的调节作用。提高大脑细胞外5-HT水平的物质,比如5-羟色氨酸和5-HT再摄取抑制剂,能够抑制部分性和全面性的发作;相反,耗竭大脑5-HT的药物会降低其对声源性、化学性和电刺激诱发的癫痫发作阈值。本实验以能很好模拟人类癫痫的大鼠为实验对象,用戊四氮(PTZ)诱发急性癲痫发作和慢性点燃癫痫模型,观察在癲痫形成过程中5-HT的动态变化,探讨5-HT在癫痫形成过程的作用机制。利用在体海马电极EEG、微透析技术系统观察自由活动大鼠在PTZ点燃癲痫形成过程中行为、脑电和大脑5-HT水平的变化,避免了麻醉药/手术操作创伤等因素的干扰,有利于检测结果的准确性。本实验的主要内容及目的:1.建立自由活动大鼠海马电极脑电和微透析模型,为探讨5-HT在癫痫形成中的动态研究奠定基础。2.研究戊四氮诱发急性癫痫发作前后大鼠行为、脑电和海马5-HT水平变化特征,和发作后海马神经元形态变化。3.研究戊四氮点燃慢性癲痫形成过程中行为、脑电、海马5-HT水平的变化,和点燃后海马神经元形态变化。4.研究提高脑内5-HT水平对PTZ点燃大鼠癫痫形成过程的影响。5.研究降低5-HT水平对PTZ点燃大鼠癲痫形成过程的影响。通过观察不同状态下海马5-HT水平的变化特征,来探讨5-HT在癲痫形成过程中可能的作用机制,为进一步研究和开发新型抗痫药物,提供实验和理论依据。第一部分自由活动大鼠海马电极脑电和微透析模型的建立目的:建立自由活动大鼠海马电极脑电和微透析模型,为海马5-HT水平的动态研究奠定基础。方法:建立自由活动大鼠海马电极脑电和微透析模型,分别在8AM、11AM、14PM、17PM、20PM等时间点,对12只自由活动大鼠进行海马电极脑电记录和微透析取样,同时监测大鼠行为、脑电活动;用HPLC检测海马透析液中5-HT及其代谢产物5-HIAA水平和5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)的水平。结果:(1)大鼠在警觉、安静、嗜睡、和熟睡状态下,脑电节律呈现由快到慢的改变。(2)海马5-HT水平在夜间比白天高,夜间海马5-HT水平,与白天其他时间比较有显著性差异(P＜0.05);海马5-HIAA水平在夜间和白天比较差异无统计学意义;5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)在夜间低,与白天其他时间点比较,有显著性差异(P＜0.05)。第二部分戊四氮诱发急性癫痫发作大鼠海马5-HT水平变化目的:研究戊四氮诱发急性癲痫发作前后大鼠行为、脑电和海马5-HT水平的变化特征,和发作后海马神经元形态变化。方法:在24只自由活动大鼠,用戊四氮诱发(60mg/kg,腹腔一次注射)癫痫发作前后,用电极和探针置于大鼠海马,进行海马电极脑电记录和微透析取样,同步观察行为、脑电和海马5-HT水平,及其代谢产物5-HIAA水平和5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)的变化;用透射电镜(TEM)观察发作后海马神经元形态变化。结果:(1)戊四氮注射后大鼠行为学出现逐级加重的发作,最后达到全面强直阵挛发作或癲痫持续状态。(2)脑电图表现为逐级加重的癫痫放电。(3)发作时海马5-HT水平明显升高与对照组、发作前和发作后比较,有显著性差异(P＜0.05);发作时5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)降低,与对照组、发作前和发作后比较,有显著性差异(P＜0.05);发作时海马5-HIAA水平变化,与对照组、发作前后比较无统计学意义;发作后5-HT水平和5-HIAA,5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)与对照组和发作前比较无统计学意义。(4)癲痫持续状态后24h透射电镜见到海马神经元水肿样变性。第三部分戊四氮点燃大鼠癫痫形成过程中海马5-HT水平变化目的:研究戊四氮点燃慢性癲痫形成过程中行为、脑电、海马5-HT水平变化,和点燃后海马神经元形态变化。方法:对大鼠每日腹腔注射戊四氮(35mg/kg/d),观察行为变化,在不同点燃时间(分别在点燃第7d、14d、21d、28d),进行脑电记录,微透析取样,在体观察24只自由活动大鼠在点燃过程中行为、脑电、和发作间期海马5-HT水平、5-HIAA水平和5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)的变化。透射电镜观察点燃后大鼠海马神经元形态变化。结果:(1)戊四氮注射后,诱发发作潜伏期逐日缩短,发作程度逐日加重,在10-14天全部点燃,点燃后出现自发癫痫发作,一只大鼠出现癲痫持续状态后死亡。(2)海马脑电随着发作潜伏期的缩短,出现癫痫波的潜伏期也缩短,随着发作程度加重,癲痫波波幅也增高,发作间期出现自发癫痫样放电。(3)点燃早期(7d),大鼠海马5-HT水平在发作间期略有升高,随着点燃时间延长5-HT水平逐渐降低,在点燃后(14d)、维持点燃(21d、28d)期间5-HT水平仍持续下降,与点燃前和对照组5-HT水平比较,差异有显著性(P＜0.05);5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)在点燃过程变化无统计学意义;5-HIAA水平在点燃时期,和维持点燃时间呈逐渐降低,点燃期、维持点燃期、对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。(4)透射电镜见到海马神经元坏死。第四部分改变大脑5-HT水平对戊四氮点燃大鼠癫痫形成过程的影响目的:研究分别用西酞普兰(提高脑内5-HT水平药物)、利血平(降低5-HT水平)对癲痫形成过程的影响,探讨大脑5-HT水平变化对癫痫形成的影响。方法:48只大鼠随机分为对照组、PTZ组(戊四氮组)、CTP+PTZ组(西酞普兰组)、RSP+PTZ组(利血平组);分别用西酞普兰(CTP)(0.5mg/kg/d灌胃)和利血平(RSP)(1mg/kg/d灌胃)干预一周后,用戊四氮(35mg/kg/d,腹腔注射)点燃形成慢性癫痫,在点燃过程的不同时间点(7d,14d,21d,28d),进行海马脑电记录和微透析取样,在体观察48只自由活动大鼠行为、脑电和发作间期5-HT水平、5-HIAA水平和5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)的变化。结果:1.在点燃期间,西酞普兰组发作潜伏期延长,发作程度轻和点燃时间延长,发作死亡率低,与PTZ组比较差异有显著性(P＜0.05);点燃后,西酞普兰组诱发发作潜伏期、发作程度的变化与戊四氮组比较无统计学意义。EEG显示在点燃期间,西酞普兰组出现癫痫波潜伏期较长,和戊四氮组比较差异有显著性(P＜0.05);点燃后,西酞普兰组出现癲痫波潜伏期与戊四氮组比较无统计学意义。点燃初期,西酞普兰组大鼠的海马5-HT水平升高,5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)降低,与对照组和戊四氮组比较有显著性差异(P＜0.05);点燃后,西酞普兰组,5-HT水平降低,与戊四氮组比较无统计学意义;与对照组比较有显著性差异(P＜0.05);西酞普兰组5-HIAA水平在点燃过程逐渐降低与对照组比较,有显著性差异(P＜0.05),与戊四氮组比较差异无统计学意义;点燃后,5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)变化与戊四氮组和对照组比较无统计学意义。2.在点燃初期,利血平组发作潜伏期缩短,发作程度重,点燃时间缩短,发作死亡率高,与对照组,戊四氮组比较,有显著性差异(P＜0.05);点燃后,发作情况与戊四氮组比较差异无显著性。EEG显示在点燃期间,利血平组出现癲痫波潜伏期缩短,与戊四氮组比较有显著性差异(P＜0.05),点燃后,利血平组出现癫痫波潜伏期与戊四氮组比较无统计学意义。点燃初期(7d),利血平组5-HT水平降低与戊四氮组和对照组比较,差异有显著性(P＜0.05),点燃后,利血平组5-HT水平逐渐下降与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)和戊四氮组比较无统计学意义;点燃过程中,5-HIAA水平,利血平组呈逐日下降趋势,与对照组比较有显著性差异(P＜0.05),与戊四氮组比较无统计学意义;点燃期间和维持点燃期利血平组5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)变化,与对照组和戊四氮组比较差异无统计学意义。结论自由活动大鼠5-HT水平夜间高于白天,存在昼夜节律变化。戊四氮诱发大鼠急性癫痫发作时海马5-HT水平明显升高;发作后海马5-HT水平恢复正常;发作程度越重,持续时间越长海马5-HT水平越高;癫痫持续状态后,大鼠海马神经元出现水肿变性。戊四氮点燃大鼠癫痫形成过程中,在点燃前,发作间期的海马5-HT水平阶段性升高,点燃后,发作间期的海马5-HT水平逐渐降低;点燃后,发作间期的海马5-HT水平明显低于正常水平;随着维持点燃时间延长,发作间期的海马5-HT水平进行性下降;癫痫形成后,大鼠海马神经元出现坏死。提高大脑5-HT水平,戊四氮点燃大鼠癫痫形成所需点燃时间显著延长;在戊四氮点燃大鼠早期,提高大脑5-HT水平,癲痫发作程度明显减轻;但提高大脑5-HT水平,未能最终阻断戊四氮点燃的癫痫形成;癲痫形成后,提高大脑5-HT水平未能抑制癲痫发作。降低大脑5-HT水平,戊四氮点燃大鼠癫痫形成所需点燃时间显著缩短;在戊四氮点燃大鼠期间,降低大脑5-HT水平,癫痫发作程度明显加重;降低大脑5-HT水平,可加速戊四氮点燃癫痫形成。