论文部分内容阅读
研究背景：慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是目前世界上较为关注的疾病之一,西方国家的患病率大约为2.6%。临床研究显示大约50%的慢性心力衰竭患者会发生心脏性猝死(sudden cadiac death, SCD),而致命性室性心律失常(ventricular arrhythmia, VA)是其首要原因。慢性心衰VA发生机制复杂,牵涉到p-肾上腺素能受体(p-AR)信号通路激活,离子通道重构,细胞钙稳态失调,CX43功能下调和心肌纤维化等多种因素。目前有关CHF患者VA/SCD发生的确切机制尚不完全清楚,更缺乏有效的防治办法。因此,进一步探讨CHF患者VA/SCD的发生机制,寻找更为有效的治疗靶点,降低慢性心衰SCD的发生是目前国内外心血管工作者研究的热点与方向。交感神经系统在慢性心衰病理生理过程中起到至关重要的作用,众多研究已经证实高交感兴奋增加慢性心衰后室性心律失常的发生,并提高死亡的风险。β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor,β2-AR)是p肾上腺素受体家族的一种亚型,在调控心脏的结构和功能中起到重要的作用。p2-AR基因的变异增加了SCD的风险；同样心脏β2-AR反应性增加后,心室颤动(ventricular fibrillation,VF)的发生率明显增加。心室肌细胞快激活延迟整流钾电流(rapid component of delayed rectifier potassium current, Ikr)是动作电位的3期复极主要电流,前期研究已经证实慢性心衰时Ikr电流明显下降；并且β2-AR激活对Ikr的抑制作用在慢性心衰过程中明显增加。而Ikr下降可以使动作电位时程(action potential duration, APD)延长,增加早期后除极(early afterdepolarizations, EADs),进一步增加VA的发生。β2-AR是一种G蛋白耦联受体,能够与儿茶酚胺结合,从而通过激活儿茶酚胺敏感性G蛋白调控心脏功能。研究表明p2-AR能够同时与Gs和Gi蛋白结合发挥作用；并且通过结合Gs蛋白激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)以及cAMP,而Gi蛋白下游的磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)则是通过降解cAMP调控蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)的激活发挥心脏收缩功能。既然β2-AR激活能够增加慢性心衰VA以及SCD发生的风险,那么在慢性心衰过程中,p2-AR的激活引起VA的机制是什么?目前还没有明确的答案,尚需进一步研究。因此,我们提出假设：在慢性心衰状态下,p2-AR激活诱导的心室肌细胞的异常复极以及VA的发生是否通过Gs/cAMP/PKA以及Gi/PDE这两条通路实现?目的：本研究的目的是验证p2-AR激活是否通过Gs/cAMP/PKA和Gi/PDE通路诱发慢性心衰室性心律失常的发生。研究内容将围绕以下几点：(1)应用主动脉缩窄法构建豚鼠慢性心衰模型,分别使用β2-AR激动剂和阻滞剂作用离体心脏,观察慢性心衰状态下心脏电生理的改变；(2)通过p2-AR激动剂以及信号通路因子的阻滞剂,观察慢性心衰心室肌细胞Ikr以及APD的改变,并进一步探讨β2-AR激动诱发慢性心衰室性心律失常可能的机制。通过本研究将为p2-AR作为慢性心衰室性心律失常的预防和治疗的靶点提供理论基础和实践依据。方法：1.主动脉缩窄法构建豚鼠慢性心衰模型,应用超声心动图技术检测慢性心衰豚鼠左心室大小、射血分数,心电图检测心率以及QTc间期；使用全细胞膜片钳技术检测慢性心衰豚鼠心室肌细胞Ikr以及APD改变；离体心脏灌流和程序性电刺激技术检测慢性心衰豚鼠左心室有效不应期改变；2.p2-AR激动剂salbutamol (10μm)以及p2-AR阻滞剂ICI118551 (10μm)通过离体心脏灌流技术作用于离体心脏,分别使用离体心电图检测以及程序性电刺激技术检测正常对照组与慢性心衰组在β2-AR激活与阻滞的状态下心率、QTc间期和室性心律失常发生率的改变；3.采用膜片钳技术检测salbutamol作用下,慢性心衰豚鼠心室肌细胞Ikr电流和APD的改变,将心室肌细胞分别使用cAMP抑制剂Rp-cAMP(100μm)、PKA抑制剂KT5720(2.5μm)、Gi蛋白抑制剂PTX(400ng)以及PDE抑制剂amrinone(30μm)进行预处理,并观察Ikr电流以及APD的改变。结果：1.慢性心衰对豚鼠心室肌细胞Ikr和APD以及左心室有效不应期的影响：主动脉缩窄12周后,慢性心衰豚鼠心室肌细胞Ikr尾电流密度(0.88±0.65)与正常对照组(1.33±0.071)相比明显降低(p<0.01),但两组电流激活电压依赖性曲线显示,半激活电压(Vhalf)并没有明显统计学差异(0.75±1.84 mV vs.1.67±0.92 mV,p>0.05),斜率(solpe)同样没有明显统计学差异(15.54±1.74 vs.16.98±0.89,p>0.05)。慢性心衰心室肌细胞APD90较正常对照组细胞明显延长(179.0±8.89 ms vs.146.8±6.48 ms,β<0.01),然而慢性心衰组和正常对照组之间APD50没有明显差异(143.9±11.3 vs.126.7±7.83 ms,p>0.05)。慢性心衰豚鼠心室肌有效不应期(82.50ms±4.79ms)与正常豚鼠(68.33±3.07)相比明显延长(p<0.05)。2.β2-AR激活对慢性心衰QTc间期以及室性心律失常的影响：正常对照组中,salbutamol延长了离体心脏QTc间期(262.2±7.29 ms vs240.8±6.07 ms,p<0.05),但慢性心衰豚鼠的心脏经过salbutamol处理后,QTc延长更加明显(293.5±6.60 ms vs.258.7±6.65 ms,p<0.01),并且两者之间的差异有统计学意义(13.52%±1.72% vs.8.87%±0.84%,p<0.05)。p2-AR选择性阻滞剂ICI118551预处理心脏后,salbutamol不能延长慢性心衰和正常对照组心脏QTC间期。Salbutamol处理后,慢性心衰室性心律失常的发生率(66.7%)与正常组(16.7%)比明显升高,使用ICI118551处理后室性心律失常发生率下降至16.7%。3.p2-AR激活通过Gs/cAMP/PKA以及Gi/PDE对慢性心衰室性心律失常的影响：Salbutamol明显抑制慢性心衰心室肌细胞Ikr电流(p<0.05),延长APD90(p<0.05)和APD50(p<0.05)；Rp-cAMP明显减弱salbutamol的作用,正常心室肌细胞Ikr下降百分比从22.78%±4.16%减少到10.41%±2.97%(p<0.05),慢性心衰心室肌细胞Ikr下降程度减少更加明显从36.97%±3.56%减少至11.44%±1.75%(p<0.01);Rp-cAMP在正常对照组中对APD的影响并不明显(p>0.05),而慢性心衰组salbutamol导致的APD90和APD50延长被Rp-cAMP阻滞(3.99%±0.80%vs.14.22%±1.18%,p<0.01；3.64%±1.07%vs.11.84%±2.13%,p<0.05)。KT5720的作用与Rp-cAMP作用相似,明显减弱了salbutamol对正常对照组(22.78%±4.16%vs.12.73%±1.32%,p<0.05)和慢性心衰组心室肌细胞Ikr的抑制作用(36.97%±3.56%vs.17.70%±1.88%,p<0.01),阻滞了salbutamol对慢性心衰心室肌细胞APD90(4.74%±2.00% vs.14.22%±1.18%,p<0.01)和APD50(3.75%±1.88% vs.11.84%±2.13%,p<0.05)的延长作用。PTX处理后,salbutamol对慢性心衰心室肌细胞Ikr的抑制作用明显增强(46.63%±2.40% vs.36.97%±3.56%,p<0.05),APD90和APD50的延长更加明显(18.74%±1.11%vs.14.22%±1.18%,p<0.05；18.3%±1.85% vs.11.84%±2.13%,p<0.05)；使用amrinone预处理心室肌细胞后,正常对照组Ikr和APD并未出现明显改变,而慢性心衰组心室肌细胞在经过salbutamol激活后,Ikr下降百分比明显增加(49.25%±1.05% vs.36.97%±3.56%,p<0.05),APD90和APD50延长也更加明显(19.95%±1.34% vs.14.22%±1.18%,p<0.01,18.79%±1.53% vs.11.84%±2.13%,p<0.05)。结论：1.β2-AR激活增加了慢性心力衰竭室性心律失常的发生；2.p2-AR激活通过Gs/cAMP/PKA和Gi/PDE通路调控慢性心衰室性心律失常的发生；抑制Gs/cAMP/PKA通路可以减少p2-AR激活所致的慢性心衰室性心律失常的发生；抑制Gi/PDE通路可以增加p2-AR激活所致的慢性心衰室性心律失常的发生。