放线菌选择性分离方法及系统分类研究

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本文第一章综述了放线菌分离方法研究进展及发展趋势,同时介绍了当前放线菌多相分类所采用的技术方法及研究进展。 本论文第二章分离并对所得到的三株链霉菌噬菌体HPA1、HPA2、HPA3进行了研究,目的是通过了解它们的特性,来选择性分离放线菌。首先对它们的形念学和稳定性进行了研究。在营养琼脂培养基平板上,它们所形成的噬菌斑形状各不相同,噬菌体HPA1所形成的噬菌斑大小中等且透明;HPA2的噬菌斑较大,中间透明边缘模糊,似日晕状;而HPA3的噬菌斑较小,针眼状。电镜观察指出,三株噬菌体的头部外形都呈球形,但其大小和尾部长度有所不同。HPA1长尾,HPA3短尾,而HPA2无尾。然后检测了它们的宿主范围。它们的宿主范围较窄,除链霉菌的某些属外,它们不能侵染链孢囊及其他属的放线菌。其中HPA2对氯仿和温度的耐受力都较强,且在60℃时,仍有21%能够存活。 本论文的第三章利用以上分离的三株链霉菌噬菌体HPA1、HPA2、HPA3对6份采自云南不同地区的土样进行分离。从实验结果来看,加入噬菌体的平板的出菌率要低于对照板,且白色链霉菌和灰色链霉菌类群的出菌率明显要少于未加入噬菌体的平板,一些其它类群的放线菌的出菌率大大增加,说明在分离放线菌时加入链霉菌噬菌体,常规链霉菌的数量大大减少,从而增加稀有放线菌的分离几率。证实了利用链霉菌噬菌体分离新类群放线菌的方法有一定的可行性。 本论文的第四章采用形态学、细胞化学、DNA G+Cmol%及16SrDNA序列分析等多相分类技术对所分离的五株放线菌进行了系统的分类研究。 经形态观察发现,菌株Y70011,Y70012形态较特殊,菌落皮革状,无气丝,两个菌株的形态有些细微的差别。插片观察产生大量晶体;菌株Y70013可形成柱状孢子,表面光滑;菌株Y70014产生的孢子卵圆状,表面有刺突;菌株Y70015可形成小孢囊。 对五株放线菌的全细胞壁氨基酸及全细胞糖型、磷酸类脂及甲基奈醌进行了分析。结果表明:菌株Y70011,Y70012,Y70013,Y70014细胞壁含L,L-DAP,糖型C型,磷酸类脂PⅡ型,醌为MK-9(H4,H6,H8);菌株Y70015细胞壁含 摘要闷贝旦里旦鱼旦旦鱼口..甲口甲贝mes。一DAP,糖型B型,磷酸类脂PW型,醒为MK一9(H2,H,,)。通过上述分类结果,可初步判断菌株Y70ozl,Y70orZ,Y70013,Y70014应归于链霉菌(Str印to柳cetes)属,菌株Y700巧应归于链抱囊菌(SterPtosPorangium)属。 通过测定五株放线菌的DNAG+Cmol%,表明其DNAG+Cmol%分别与其相应属DNAG+Cmol%相吻合。 165 rDNA序列分析结果最后确定了各菌株的归属,通过将测得的165 rDNA序列与GenBank中序列相比较最终确定,菌株Y700ll,Y70012,Y70013,Y70014为链霉菌,菌株Y700巧是链抱囊菌属的放线菌。其中菌株Y70011,Y70012,Y70014同与之亲源关系最近的菌株的序列相似性分别97.762%,97.629%,97.323%,应为新种。而菌株Y70011,Y70012之l旬的序列相似性为99.929%,DNA一DNA同源性分析即DNA一DNA分子体外杂交表明,两株菌的DNA同源性为51 .9%,所以为不同的链霉菌属的新种。菌株Y70013,Y70015同与之亲源关系最近的菌株的序列相似性分别98.855%,98.64%,序列相似性在98%以上的模式菌分别有2株和5株,通过DNA一DNA分子杂交表明,菌株Y70013与2株模式菌的DNA同源性都在70%以下,所以为一新种。菌株Y70015与长抱链抱囊(Ste毕to护orangium longi胡orom)JeM3 1 06的DNA同源性为92.89%,所以与之为同一种。 通过上述多相分类研究,确定了五株放线菌的分类地位及系统发育关系。
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