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背景与目的:慢性肾脏病常伴随炎症和纤维化病变,而炎症贯穿于肾纤维化全过程。肾小管上皮细胞及其间充质转分化(EMT)以及巨噬细胞是肾脏炎症和纤维化形成的重要机制。我们前期研究发现,肾小管上皮细胞可通过转分化形式表达天然免疫分子DC-SIGN,参与肾小管间质炎症和纤维化形成。进一步发现巨噬细胞可通过表达DC-SIGN并与TLR4相互作用,参与肾脏局部炎症调节。转录因子RUNX1是造血干细胞分化的重要调节因子。我们前期研究发现RUNX1可能参与TGF-β诱导的EMT调控,基于炎症与纤维化的紧密关系,推测其可能也参与肾脏炎症和纤维化形成。为此本研究在前期工作基础上,拟从肾脏炎症和纤维化两个层面并以上述细胞为研究对象,探讨RUNX1对巨噬细胞和肾小管上皮细胞参与肾脏炎症和纤维化病变中的调控作用,以及可能涉及的分子机制。方法:(1)利用人单核巨噬细胞系THP-1、小鼠巨噬细胞系RAW 264.7以及小鼠原代腹腔巨噬细胞(PEM),分别给予LPS(100 ng/mL或1000 ng/mL)刺激,采用RT-qPCR及Western blot检测RUNX1的mRNA及蛋白表达水平;继而利用siRNA技术干扰RUNX1的表达,PEM细胞经LPS刺激并采用RT-qPCR和ELISA,检测炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌变化;随后利用RAW 264.7细胞构建过表达RUNX1稳转株,经LPS刺激并采用RT-qPCR及ELISA,检测炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌变化;进一步利用RUNX1抑制剂(Ro 5-3335)干预,采用RT-qPCR和ELISA检测上述炎症因子分泌变化。(2)利用siRNA技术干扰RUNX1表达,PEM细胞经LPS刺激并采用Western blot,检测JNK、ERK、p38及p65的磷酸化水平以及IκBα降解状况;继而利用RUNX1抑制剂(Ro 5-3335)干预,采用双荧光素酶基因报告系统,检测RUNX1及其不同截短体(1-242aa、50-178aa、243-453aa)对p50、p65及p105诱导NF-κB荧光素酶活性的影响;随后采用免疫共沉淀实验,分别检测p50、p65及p105与RUNX1结合状况。(3)进一步利用上述RUNX1抑制剂干预,体内观察对LPS诱导内毒素休克模型小鼠生存状况以及炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α分泌的影响。(4)利用人肾小管上皮细胞(HK-2)和大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,分别给予EMT诱导因子TGF-β刺激,采用RT-qPCR及Western blot,检测上述肾小管上皮细胞RUNX1的mRNA及蛋白表达水平;继而利用siRNA技术干扰RUNX1表达,HK-2细胞经TGF-β刺激,采用光学显微镜观察EMT中细胞形态变化;此外利用HK-2细胞构建过表达RUNX1稳转株,结合siRNA干扰技术,采用RT-qPCR检测EMT标志物Snai2、Vimentin表达;随后利用上述人和大鼠肾小管上皮细胞构建过表达RUNX1稳转株,采用RT-qPCR及Western blot,检测上述标志物Snail、Snai2、Vimentin、α-SMA表达。(5)进一步利用建立单侧输尿管梗阻纤维化小鼠模型(UUO),采用RT-qPCR检测肾组织中RUNX1、TGF-β、Snail、Snail2、Vimentin、Col1a1、Fibronectin等表达变化。结果:(1)RUNX1可在巨噬细胞中组成性表达,而LPS可下调其表达;上调或下调巨噬细胞RUNX1表达,则可明显促进或抑制LPS诱导的炎症因子IL-1β及IL-6分泌。(2)此外发现RUNX1不影响TLR4下游信号通路的JNK、ERK、p38、p65磷酸化水平以及IκBα的降解,但其可明显增强p50、p65和p105诱导的NF-κB活力,上述效应可被RUNX1抑制剂予以抑制。进一步发现RUNX1可与p50相互结合。(3)体内实验进一表明,利用RUNX1抑制剂干预,则可抑制LPS诱导的内毒素性休克模型小鼠肾内炎症因子IL-6分泌,减轻小鼠肾脏炎症并改善其生存状况。(4)另一方面,RUNX1可在促纤维化因子TGF-β诱导的肾小管上皮细胞中明显表达;上调或下调RUNX1表达,则可显著促进或抑制TGF-β诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞形态转变以及EMT标志物Snai2及Vimentin的表达。(5)体内实验进一步表明,伴随RUNX1在纤维化小鼠模型肾组织中明显表达,EMT及纤维化指标Snail、fibronectin、Col1a1、CCL2及TGF-β均显著上调,且小鼠肾纤维化程度明显加重。结论:RUNX1可通过调控NF-κB信号通路,调节巨噬细胞参与肾脏炎症,而RUNX1与NF-κB p50相互作用可能是其发挥上述作用的分子机制;此外RUNX1也参与肾小管上皮细胞EMT及肾纤维化过程,提示其可能是调控肾脏炎症中纤维化形成的关键因子。利用RUNX1抑制剂对此具有抑制效应,由此将可成为肾脏等炎症性疾病新的治疗靶点及干预手段。