研究背景和目的肝内胆管癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma, ICC)是原发于肝脏的恶性肿瘤,来源于次级胆管远端微小胆管的上皮细胞,其恶性程度很高、预后差；虽然发病率不高,约占原发性肝癌的10%～20%,占所有胆管癌的10%,但近几十年来呈上升趋势,尤其是西方国家。目前,手术仍是主要的治疗方法,但是由于其临床症状不明显,早期诊断很困难,限制了根治性手术的开展,对于不能手术的ICC患者,肝脏移植在远期效果上还存在很大的争议。化疗方面,胆道肿瘤化疗方案多以采用顺铂±吉西他滨疗效较好,但对于ICC还没有大型的临床研究数据支持。由于ICC微环境丰富、异质性差别大,而且具有很强的促结蹄组织增殖能力,这使得其对一般的化疗容易产生耐受性。因此寻找敏感的化疗药物,解决化疗耐受性问题,对于治疗ICC具有十分重要的意义。表观遗传学机制主要包含脱氧核糖核酸(DNA)的甲基化、非编码核糖核酸(RNA)调节、组蛋白修饰、基因与蛋白的磷酸化过程以及溴蛋白结构域修饰等,它们在环境因素影响的疾病中起着很重要的作用,在ICC的病理生理过程中,多种表观遗传学机制也发挥了重要的作用。目前,针对表观遗传学机制开发的药物被认为在治疗癌症、心脑血管慢性疾病和精神神经等疾病中具有巨大潜力,并且有很多药物已经进入各期临床研究。而应用于ICC治疗的基础及应用研究还属于相对空白的区域。因此从表观遗传学位点调控出发,开发的表观遗传学药物在治疗ICC方面可能具有很好的前景,而组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)抑制剂HC toxin(Helminthosporium carbonum toxin, HC toxin)可能成为其中的一种。近年来发现Notch信号通路的激活可使成熟的肝细胞转变成ICC前体细胞,这使得Notch信号通路在ICC的发病机制上的研究受到极大的关注,同时,Notch通路也受到了表观遗传学方面的调控,尤其是HDAC修饰对该通路的影响存在不小的争议,这提示我们在开发HDAC相关类药物用以治疗ICC时必须考虑其对Notch通路可能的影响。基于以上研究背景,本课题分为三组实验,主要目的有三：实验一：针对ICC细胞株,进行表观遗传学药物的筛选,得出对ICC细胞较为敏感的药物,为ICC的新药物化疗提供前期实验基础。实验二：探讨HDAC抑制剂HC Toxin对ICC细胞的在增殖、细胞周期、凋亡等多方面生物学功能上的影响。实验三：探讨HDAC抑制剂HC Toxin对ICC细胞Notch信号通路的影响。方法针对三组实验,分别采用以下方法完成实验一：1.针对ICC细胞株RBE,采用CCK-8细胞活力检测法,对Cayman公司提供的表观遗传学药物文库No.11076,进行单一时间点的药物初步筛选。2.用CCK-8细胞活力检测,将上诉初步筛选所得出的敏感药物以及吉西他滨(Gemcitabine)对HuCCT1、CCLP-1、TFK-1、RBE等多种ICC细胞进行处理,在多浓度梯度上作抑制效果的比较,并确定其半数有效抑制率。实验二：1.用细胞计数法及平板细胞克隆形成实验,检测HC Toxin对ICC细胞系CCLP-1增殖及克隆形成能力的影响。2.用光学显微镜下观察吉姆萨染色前后HC Toxin对ICC细胞CCLP-1的形态学影响,探索该过程中可能的生物学过程。3.用7-AAD染色的流式细胞技术,检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后的细胞周期的分布,探索HC toxin对ICC细胞周期的影响。4.用Annexin V FITC和7-AAD联合染色的流式细胞技术,检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后细胞的凋亡情况,探索HC toxin对细胞凋亡的影响。5.在上述实验产生阳性结果的前提下,用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后,凋亡相关蛋白caspase 3、bax、 bcl-2、cytochrome c等的表达水平变化,探索HC toxin可能的细胞凋亡途径。实验三：1.用反转录实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后Notchl等部分重要基因转录情况变化。2.用细胞免疫荧光试验(Immunofluorescence, IF)及蛋白免疫印迹法(Western Blot),检测ICC细胞CCLP-1经HC toxin处理一定时间后Notch;通路相关蛋白notch1、Hesl等的表达变化。3.用CCK-8细胞活力检测法,检测’Notch通路抑制剂DAPT单独或联合HCtoxin对CCLP-1的细胞活力的影响。结果实验一：1.所选表观遗传学文库共有95种表观遗传学药物,其中27 uM的高浓度药物作用下,有22种表观遗传学药物对RBE细胞有抑制作用,包括HDAC抑制剂12种(HC Toxin, TSA, SAHA,4-iodo-SAHA, SB939, CAY10398, M344, ITF 2257, Oxamflatin, Scriptai, CBHA, CAY10603);组蛋白甲基化转移酶抑制剂3种(Chaetocin, GSK 343, BIX01294);组蛋白去甲基化转移酶抑制剂2种(PFI-1, GSK-J4);磷酸化抑制剂2种(Bromosporine, JQ1);溴蛋白结构域抑制剂1种(phthalazinone pyrazole); DNA甲基化酶抑制剂1种(Neplanocin A);而在3 uM药物浓度下对RBE细胞仍具有强烈抑制作用的有HC Toxin, TSA, SAHA,4-iodo-SAHA及Chaetocin,其中前4种均为HDAC抑制剂。2.对HC Toxin, TSA, SAHA和吉西他滨(Gemcitabine, GEM)进行多种细胞株、多浓度梯度的药效比较,发现HC toxin的抑制作用均较TSA、SAHA、 TSA、GEM等强烈,其次是TSA、而GEM最弱。其中,HC toxin对CCLP-1,HuCCT1, TFK-1,RBE的半数有效抑制率,分别为297.6+80.4 nM、520.0+43.0 nM, 854.6+86.9 nM、713.7+27.3 nM.实验二：1.细胞计数表明：HC toxin能抑制CCLP-1细胞增殖,并呈现一定的浓度与时间依赖性。平板克隆形成实验表明：经不同浓度HC toxin处理后,细胞克隆形成能力减弱,在HC toxin浓度大于100 nM时与药物浓度呈正相关,50 nM以内差异无统计学意义。2.用光学显微镜观察吉姆萨染色前后的CCLP-1形态变化显示,经HC toxin处理48小时后出现：①细胞密度变小,细胞体积缩小,细胞质成分减少,分裂像减少；②部分细胞变圆脱落,带凋亡小体的细胞明显增多,而细胞胀大破裂者少见； ③树突状结构。计算出现凋亡小体的细胞数量,发现HC toxin引起细胞出现凋亡小体与HC toxin浓度呈正相关关系。3.7-AAD染色的流式细胞技术实验显示,与对照组相比实验组经HC toxin处理48小时后,G0/G1期细胞比例明显上升,G2/M期细胞比例明显下降,呈现浓度依赖性,而S期细胞比例变化不具统计学意义。4. Annexin V FITC联合7-AAD染色的流式细胞技术实验显示,与对照组相比,实验组经HC toxin处理48小时后早期凋亡、晚期凋亡及总凋亡的细胞比例均明显增多,呈现浓度依赖性,差异具有统计学意义。5. Western blot实验表明,经HC toxin处理48小时后,CCLP-1细胞中某些凋亡相关蛋白cytochrome c、bax/bcl-2的相对表达量在各个浓度组的差异无统计学意义,caspase 3在HC toxin浓度为400 nM时较对照组有增加,而其他实验组与对照组差异无统计学意义。实验三：1. RT-qPCR检测表明经HC-Toxin处理一段时间后,CCLP-1中Notchl等6个基因转录水平发生了一定的改变。STAT3等10个基因转录水平变化没有统计学意义。2. Immunofluorescence实验和Western blot实验表明,HC toxin处理CCLP-1细胞后,Notch通路被激活,Notch通路相关蛋白Notch1、Hes1表达量明显增加,并呈现浓度相关性。3.CCK-8细胞活力检测试验显示,Notch通道阻滞剂DAPT浓度低于50 uM时对CCLP-1细胞无明显的抑制作用,但可以明显增强200 nM HC toxin对CCLP-1细胞活力的抑制作用,当DAPT大于50 uM时对CCLP-1细胞具有明显的抑制作用,并与HC toxin呈现协同作用.结论：1.多种表观遗传学药物在体外能对ICC细胞RBE具有强烈的抑制作用,其中HDAC抑制剂尤为突出,提示HDAC有可能是抑制RBE细胞增殖的敏感靶位,但证据还不够充分。2. HC toxin对多种ICC细胞具有强烈的抑制作用,效果比其他HDAC抑制剂和吉西他滨强烈,并呈现一定的浓度与时间依赖性。其对ICC细胞的作用是综合的,多方面的,与抑制细胞增殖,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡有一定关系。3.HC toxin对CCLP-1细胞活力既有抑制作用也有促进作用,抑制作用大于促进作用,促进作用可能与HC toxin激活Notch信号通路有关,可通过联合Notch通路阻滞剂抵消HC toxin对CCLP-1的促进作用。