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抗菌肽是一类由生物体内特定基因编码产生的小分子多肽,是生物体用以抵御病原微生物入侵机体的重要屏障。具有较好的热稳定性和水溶性,杀菌谱广,对较低pH或较高pH及较大的离子强度均具有较好的抵抗能力,只对原核细胞及发生病变的真核细胞表现出抑制作用,而对真核细胞几乎不产生抑制作用,并且被作用的菌株一般情况下不会产生耐药性。基因工程法是目前大量获得抗菌肽的有效方法。Cryptonin抗菌肽是从蝉中发现的一类抗菌肽,一共含有24个氨基酸残基,具有两亲性的α-螺旋结构域,相对分子质量约为3000Da,Cryptonin抗菌肽的杀菌能力非常强。本试验根据GenBank (ID:GI:206557920)中注册的Cryptonin抗菌肽的氨基酸序列,作为目的多肽。选用毕赤酵母偏爱密码子设计抗菌肽基因及其引物。并将目的基因连接到pPICZα A质粒上,构建pPICZα A-Cryptonin外分泌型表达载体。通过PCR鉴定、双酶切鉴定及基因测序,可证实已获得的表达载体即为目的重组载体。本研究选择巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115作为Cryptonin抗菌肽的表达系统。经大量制备重组质粒pPICZα A-Cryptonin后,用限制性内切酶SacI对重组质粒pPICZα A-Cryptonin单酶切使其线性化,通过电转化将线性化的重组质粒pPICZα A-Cryptonin转入毕赤酵母GS115内。利用含梯度浓度Zeocin的平板筛选转化子,获得高拷贝转化子。对筛选出的转化子进行PCR鉴定。通过对获得的高拷贝转化子进行甲醇诱导表达,取表达上清液进行抑菌试验。利用Sephadex G-50层析柱分离纯化表达上清液,并利用Tricine-SDS-PAGE(?)泳检测目的蛋白。最后采用Bradford法对抗菌肽定量分析。试验结果表明：本试验成功地构建了Cryptonin抗菌肽的表达载体pPICZα A-Cryptonin,并成功将其转化到毕赤酵母GS115中,获得重组酵母菌GS115-pPICZα A-Cryptonin。利用甲醇诱导重组酵母菌GS115-pPICZα A-Cryptonin进行表达获得的表达上清液,经抑菌试验证明其具有一定的抗菌活性,并且Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果表明表达上清液中含有目的蛋白,即成功地在毕赤酵母GS115中表达了Cryptonin抗菌肽。表达产物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑制作用,抑菌圈直径分别达到2.3cm、2.2cm和1.3cm。表达产物经分离纯化后获得高纯度抗菌肽,测定计算得表达量为8.3mg/L