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反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASON)药物是人工合成的DNA或者RNA单链片断,其核苷酸序列可与靶mRNA 或靶DNA 互补,抑制或封闭编码致病蛋白的基因,或诱导RNase H 识别并切割mRNA , 从而阻碍该基因的表达,与传统药物相比,反义药物具有高特异性、低毒和高效的特点。现已成为基因功能分析和药物开发的强有力工具。CT102是本实验室以IGF-1R基因为靶标筛选出来的20mer长度的反义寡核苷酸药物,结构中采用全硫代修饰,由于体内、体外抗肿瘤活性评价显示其具有较好抗肝癌作用,因此有望开发成为基因治疗肝癌的有效药物。为了满足该药物临床前药效学、药代动力学以及安全性评价研究所需的样品量,同时降低研发成本,其制备规模必须实现百克级的中试生产。本课题即是针对CT102原料药的中试生产开展工艺研究,包括实验室小试规模的合成工艺建立,中试生产的工艺优化,纯化与冻干工艺的研究与放大等。为了确保CT102药物的质量可控,质量控制研究必不可少,原料药的含量测定作为质量控制的一部分贯穿于该药研发的始终,也是评价合成工艺所必需的,因此,本课题还进行了CT102原料药含量测定的研究。
目的：在国产试剂条件下,优化出合成反义寡核苷酸药物CT102的最佳工艺条件,以降低合成成本,并对合成粗产品进行中试纯化、冻干制剂及建立该药物离子交换高效液相色谱(IE-HPLC)含量测定方法,以满足该药物床前药效学、药代动力学的研究的需求量。为进一步推动国内核酸药物研发提供借鉴。
方法：合成工艺利用亚磷酰胺反应原理,采用流过式固相合成法,使用 ÄKTA OligoPilot 100 合成仪进行,通过选取影响合成的关键因素,包括脱保护试剂、活化剂和碱基浓度等,通过设计正交试验,以合成粗品的产率和反相HPLC纯度为评价指标对合成工艺进行优化；中试纯化工艺采用阴离子交换液相色谱法,同时采用电导和紫外监测纯化过程,紫外监测选择260nm、290nm和297nm三个波长,梯度洗脱程序确定为：在1个柱体积(15L)内流动相B液先从0%线性梯度升至45%,之后4个柱体积(60L)内B液从 45%线性梯度至 90%,期间观察出口电导率变化,当出口电导率达到105mS/cm时(B液60%左右),等度洗脱1个柱体积(15L)；然后直接切换B液为100% 等度洗脱,纯化过程的流速为 100L/h,洗脱样品采用分段收集方式在出口电导率为105mS/cm时开始收集,观察紫外吸收图谱,UV297nm值快速上升时,以每瓶2L依次收集至UV260nm值降至1AU时停止收集,分段收集的样品取样经过反相HPLC分析后将纯度合格的部分合并。经离子交换色谱分离得到的纯度合格的样品进一步进行切向流超滤脱盐获得纯品。脱盐后的纯品采用真空旋转蒸发浓缩至规定浓度,除菌过滤后进行冷冻干燥。CT102原料药的含量测定采用阴离子交换HPLC法进行测定,色谱柱采用DNAPac PA-100阴离子交换柱(4mm×250mm)；流动相A为1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠/25 mmol/L三羟基氨基甲烷,5%乙腈(V/V),流动相B为1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠/25 mmol/L三羟基氨基甲烷/1.5 mol/L溴化钠,5%乙腈(V/V)；洗脱梯度为0 min-15 min,40%-100%B；柱温50℃；流速为1 mL/min；检测波长为260 nm。采用外标法进行含量测定。
结果：该工艺在使用国产试剂的条件下进行,成本低,工艺优化后小试合成的粗品产率达到151.32 OD260/μmol,反相HPLC测定纯度达到88.79%,与对照组采用进口试剂合成结果相比较,产率和纯度相当。将该工艺应用于20mmolCT102中试合成,连续合成三批,产率和反相HPLC纯度结果为：20120307批次产率和反相HPLC纯度为139.5 OD260/μmol和79.12%, 20120314批次产率和反相HPLC纯度为144.5 OD260/μmol和77.76%,20120321批次产率和反相HPLC纯度为141.8 OD260/μmol和84.57%,而且大规模纯化后冻干后样品反相HPLC分析纯度大于96%。建立的离子交换色谱对CT102原料药的含量测定方法能够使合成过程中产生的主要杂质不完全硫代序列(P=O)实现与全长序列n的有效分离,且CT102在75 μg/mL-1200 μg/mL范围内呈良好的线性关系, r=0.9999,仪器精密度良好,RSD为0.64%,检测限为5μg/mL,定量限为15μg/mL。
结论：使用国产试剂优化出的工艺条件稳定,放大到中试生产中,合成粗品产率和反相HPLC纯度结果符合后期纯化要求,可以作为CT102中试生产工艺,采用离子交换色谱法大规模纯化后样品纯度及收率可以满足临床前研究质量标准的要求以及临床前药效学、药代动力学以及安全性评价等研究需求。建立的反义寡核苷酸药物CT102的离子交换高效液相色谱(IE-HPLC)含量测定方法准确可靠,体系稳定,并且经济简便,不完全硫代杂质与主峰分离良好,可用于CT102原料药的含量测定,也为规模化制备和终产品的质量控制提供可靠保障。