背景与目的瓦氏效应(Warburg effect)认为肿瘤细胞中糖酵解明显增强,并且利用糖酵解方式取代一般正常细胞的有氧氧化获得能量。但是,许多癌细胞仍然拥有不同程度的线粒体的呼吸活动,并且不完全依靠糖酵解作为唯一的产能途径,即不同的肿瘤细胞其能量依赖的供应方式不同。因此,对各肿瘤细胞复杂的能量供应主要方式和代谢变化的理解,是成功开发新的癌症治疗药物和有效治疗方案必不可少的。对于细胞中能量代谢物质含量的测定,本研究过去曾采用了荧光素酶反应体系,测定样品中ATP的发光值,但这方法对外界的温度和光线非常敏感,且操作较为复杂、灵敏度低、速度慢。后来又使用了反相高效液相色谱法,全缓冲液作为流动相,梯度洗脱。这种方法分离效果好,可长期使用会使柱内填充物塌陷。因此,本实验将建立一种稳定和灵敏度高的反相高效液相法,用以检测不同条件下细胞以及动物组织的能量代谢物质。本论文旨在检测一些肿瘤细胞株的能量代谢方式,为一些新的肿瘤治疗方案提供理论依据。同时测定动物体内不同组织的能量代谢物质含量,并探讨外部补充能源对单侧输尿管结扎所致的肾纤维化和四氯化碳所致的肝损伤的预防作用,为它们的防治提供实验指标。方法一、优化反相液相法:1、高效液相测定能量代谢物质方法分析条件的优化:根据能量代谢物质(ATP、ADP和AMP)的物理、化学性质等选择合适的色谱柱、检测器及波长、色谱分析方法、流动相、流动相的pH值、流速和柱温。2、能量代谢方法学的建立:(1)标准曲线的建立:在选定的分析条件下,按外标定量法,ATP、ADP及AMP质量浓度分别为:组织0、5、10、25、50、100和200μg/mL;细胞0、0.05、0.1、1、5、10、25、50、100和200μg/mL。(2)精密度:日内和日间精密度试验均含低、中、高3种浓度,日内试验各浓度在l天内分别进样5次,日间试验各浓度每天进样1次,连续观测5天。(3)回收率:在已知浓度的样品中,分别加入低、中、高三种不同浓度的ATP、ADP和AMP混合标准品,按样品测试方法测定其加样回收。(4)ATP、ADP和AMP的定性分离:分别上三个样品:标准品、样品以及样品加标准品。比较这三个样品的出峰时间以及峰面积,以确定样品的成分。二、建立不同代谢条件下的细胞模型:1、选择10种不同类型细胞株进行系统检测:细胞株分别为:ECV304(人脐静脉内皮细胞) (DMEM培养基内含1g/L葡萄糖)、A549(人肺腺癌细胞)(RPMI-1640培养基)、K562(人慢性粒细胞白血病细胞) (RPMI-1640培养基)、H460(人肺癌细胞)(RPMI-1640培养基)、MCF7(人乳腺癌细胞)(RPMI-1640培养基)、P388(小鼠白血病细胞) (RPMI-1640培养基)、C6(大鼠神经胶质瘤)(DMEM培养基)、Ana-1(小鼠巨噬细胞) (RPMI-1640培养基)、SH-SY5Y (人神经母细胞瘤) (DMEM培养基)和肿瘤细胞(RPMI-1640培养基)。2、在不同能量代谢条件下建立细胞模型:选择(1)葡萄糖或者无葡萄糖;(2)常氧或者缺氧;(3)左旋葡萄糖或者右旋葡萄糖;(4)葡萄糖浓度梯度;(5)腺苷浓度梯度:(6)寡霉素浓度梯度;(7)脂多糖;(8)2-脱氧葡萄糖等药物的作用下,用优化的反相高效液相色谱方法,检测不同条件下细胞代谢中能量代谢物质的含量,以确定上述细胞的能量依赖方式。三、测定各脏器组织的能量代谢物质,并建立肝损伤和肾纤维化小鼠模型:1、比较正常小鼠各脏器中能量代谢物质的含量:雄性健康的昆明小鼠3只,取出小鼠的心脏、肺脏、肾脏、脑和骨骼肌,用优化的反相高效液相色谱方法检测各脏器中能量代谢物质的含量。2、建立小鼠的急性四氯化碳肝损伤模型:昆明小鼠共20只,将其随机分为4组,即对照组、四氯化碳组、果糖-1,6-二磷酸组和四氯化碳加果糖-1,6-二磷酸组。分别腹腔注射相应的药物。4h后,对果糖-1,6-二磷酸组和四氯化碳加果糖-1,6-二磷酸组再补充注射相同剂量的果糖-1,6-二磷酸。再过4h后取出肝脏,用优化的反相高效液相色谱法检测其能量代谢物质的含量。3、小鼠肾输尿管结扎致肾纤维化模型:昆明小鼠共60只,将其随机分为4组,即假手术组、手术对照组、葡萄糖组和果糖-1,6-二磷酸组。手术对照组、葡萄糖组和果糖-1,6-二磷酸组在其左侧输尿管中、下1/3处2次结扎;而假手术组,则游离左侧输尿管但不结扎。分别腹腔注射相应药物,注射1天、3天和7天后处取出肾脏,用优化的反相高效液相色谱法检测其能量代谢物质。结果1、高效液相方法相关参数的确定:选择YMC牌C18色谱分析柱(5μm, 250mm×4.6mm)耐水性色谱柱、254nm波长的SPD-10Avp检测器、反相液相色谱分析方法、180mM的磷酸二氢钾(含5%甲醇且pH=6.25)缓冲液的流动相、流速为0.8mL/min和柱温为25℃以下。2、能量代谢物质检测方法的建立:(1)建立动物组织和细胞样本能量代谢物质的标准曲线:结果显示浓度与峰面积均有良好的线性关系。(2)检测仪器的精密度和回收率:结果表明,日内和日间的精密度均可获得较好的重复性,二者相对标准偏差(RSD)分别在1.5%和5.1%以下;测得回收率为ATP 99%～108% ,ADP 96%～104%,AMP 94%～l19%。(3)ATP、ADP和AMP的定性分离:样品出峰的保留时间与标准品相近。样品中加入混合标准品的3个峰均增高,与加入的标准品有量效关系。由此可以确定样品腺苷酸色谱图中的ATP、ADP及AMP的成分。3、不同代谢条件下的细胞能量代谢物质的测定结果:(1)以上提及的10种细胞株,在葡萄糖或无葡萄糖条件下,检测细胞能量代谢物质。结果显示当细胞数较多(>1×106)和作用时间较长(>6h)条件下,有葡萄糖时ATP的含量是无葡萄糖培养的2倍(p<0.05)。(2)SH-SY5Y细胞在加入寡霉素后,有葡萄糖培养和无葡萄糖培养时,ATP均较对照组下降明显(p<0.01)。SH-SY5Y细胞在2-DG(25mM)作用3h,在葡萄糖培养时,ATP含量稍微下降;而在无葡萄糖培养时,ATP含量下降明显,约为对照组的一半(p<0.01)。SH-SY5Y细胞在葡萄糖或无葡萄糖加常氧或者缺氧的条件下培养6h。结果显示SH-SY5Y细胞在有葡萄糖培养时,常氧组的ATP含量比缺氧组的ATP含量稍微增高(p<0.05),而无葡萄糖培养时,常氧和缺氧组变化不明显。(3)H460细胞和C6细胞在加入寡霉素(1μg/mL)后,葡萄糖培养和无葡萄糖培养时,ATP均较对照组明显下降(p<0.01)。在葡萄糖和无葡萄糖条件下,加入腺苷(2mM)能显著增加细胞ATP含量(p<0.01);同时加入腺苷和寡霉素能部分逆转寡霉素的作用,使ATP含量部分恢复,与单独加寡霉素相比,前者ATP含量较高(p<0.01)。(4)A549细胞在葡萄糖和常氧或者缺氧的条件下,加入寡霉素(1μg/mL)和腺苷(2mM)。结果显示常氧的对照组、寡霉素组和腺苷组的ATP含量与缺氧相应的3组相比无明显变化。在葡萄糖条件下,寡霉素对A549细胞的ATP影响不大。但腺苷却能显著升高ATP的含量(p<0.01)。在无葡萄糖和常氧或者缺氧的条件下,加入寡霉素和腺苷。结果显示常氧的对照组和腺苷组的ATP含量比缺氧的相应的两组的ATP含量略有增加(p<0.05)。在葡萄糖条件下,寡霉素能显著减少A549细胞ATP的含量(p<0.01)。腺苷却能显著升高ATP的含量,约为对照组的两倍(p<0.01)。(5)MCF7细胞在加入寡霉素(1μg/mL)后,葡萄糖培养时ATP下降不明显,无葡萄糖培养时ATP较对照组明显下降(p<0.01)。它在葡萄糖和无葡萄糖条件下,加入腺苷(2mM)能显著增加细胞ATP(p<0.01);同时加入腺苷和寡霉素能完全逆转寡霉素的作用,使ATP含量恢复至对照组水平(p<0.01)。(6)K562细胞加入不同浓度的寡霉素(0,0.5,1,2,5和10μg/mL)作用24h。结果显示在葡萄糖培养时ATP含量下降不明显,但是在无葡萄糖培养时ATP含量明显下降(p<0.01)。它在葡萄糖浓度梯度的条件下培养12h,结果显示:在浓度0g/L、1g/L和2g/L时,随着浓度的增加ATP含量也升高,各组间有显著差异(p<0.05)。但在浓度4g/L、6g/L和8g/L时ATP含量大致一样,组间无显著差异。在葡萄糖培养和无葡萄糖条件下,加入不同浓度的腺苷(0,0.5,1,2,4和8mM)作用6h,结果显示ATP含量随着腺苷浓度的增加而增加,与对照组比较,有显著性差异(p<0.05),但是浓度为4 mM的ATP含量与浓度为8mM的ATP含量无差异。在左旋葡萄糖(2g/L)或者右旋葡萄糖(2g/L)的条件下培养6h,结果显示ATP含量在左旋葡萄糖中没有变化,而在右旋葡萄糖中ATP明显比对照组增加,组间有显著差异(p<0.05)。在葡萄糖条件下,加入2-DG(5mM)作用3和12h,结果显示在作用3h后2-DG(5mM)不能明显地降低ATP含量,但作用12h后,ATP的含量比对照组减少了一半(p<0.01)。(7)P388细胞加入不同浓度的寡霉素(0,0.5,1,2,5和10μg/mL)作用6h。结果显示在葡萄糖培养时ATP含量下降不明显,但是在无葡萄糖培养时ATP含量明显下降(p<0.01)。(8)ECV304细胞加入寡霉素后,有葡萄糖培养时ATP下降不明显,无葡萄糖培养时ATP较对照组明显下降(p<0.01)。ECV304细胞在葡萄糖和无葡萄糖条件下,加入腺苷(2mM)能显著增加细胞ATP(p<0.01);同时加入腺苷和寡霉素能完全逆转寡霉素的作用,使ATP含量恢复至对照组水平(p<0.01)。在2-DG(25mM)作用2h后,在葡萄糖培养时,ATP含量不改变;而在无葡萄糖培养时,ATP含量下降明显,约为对照组的一半(p<0.01)。在葡萄糖和无葡萄糖条件下,加入果糖-1,6-二磷酸(25mM)作用3h, ATP含量较对照组稍微增加(p<0.05)。(9)胸腺细胞在葡萄糖和均加入寡霉素(4μg/mL)的条件下,加入不同浓度的腺苷(0,0.1,0.2,1和2mM)作用10h,结果显示,腺苷浓度在0,0.1和0.2 mM时,其ATP基本没变化,而腺苷浓度在1mM和2mM时,ATP与对照组相比,显著升高(p<0.05)。同时加入腺苷和寡霉素则能部分逆转寡霉素的作用(p<0.01)。在葡萄糖培养和均加入腺苷(2mM)的条件下,加入不同浓度的寡霉素(0,1,2,4和8μg/mL)作用10h,结果显示寡霉素浓度为0μg/mL时,其ATP约为2.5μg/mL,而寡霉素浓度为1,2,4和8mg/mL时ATP均下降为0.5μg/mL左右(p<0.01)。在葡萄糖培养和无葡萄糖条件下,分别加入不同浓度的腺苷(0,0.5,1,2和4mM)作用4h,结果显示当浓度在0-2mM阶段时, ATP含量随药物浓度的增加而增加(p<0.05),然而当浓度为4mM时,ATP浓度较浓度为2mM时减少(p<0.05)。(10)Ana-1细胞加入寡霉素和腺苷作用6h。结果显示葡萄糖培养时,寡霉素能减少ATP含量,约为对照组的一半(p<0.01)。腺苷能增加ATP含量,约为对照组的一倍(p<0.01);无葡萄糖培养时寡霉素能明显减少ATP含量(p<0.01)。腺苷却能增加ATP含量,约为对照组的一倍(p<0.01)。并且同时加入腺苷和寡霉素后细胞的能量都较单独加寡霉素的高(p<0.01)。Ana-1细胞在葡萄糖培养条件下,加入腺苷(2mM)和脂多糖(LPS)(1μg/mL)分别作用2h和6h,结果显示:脂多糖能不同程度的降低ATP的含量,但同时加入腺苷和脂多糖与单独加脂多糖相比,前者ATP的含量显著增高(p<0.05)。4、小鼠模型中各脏器组织的能量代谢物质测定结果:(1)比较正常小鼠各脏器中能量代谢物质的含量,结果显示ATP含量最高的是骨骼肌,接下来是心脏,而肺脏次之,脑和肾脏的ATP含量最少(p<0.05)。(2)小鼠的急性四氯化碳肝损伤模型的实验结果显示,四氯化碳组的ATP明显较对照组下降,而四氯化碳加果糖-1,6-二磷酸组的ATP明显较四氯化碳组增高一倍(p<0.05)。(3)小鼠肾输尿管结扎模型的结果显示随着时间的延长,对照组、葡萄糖组和果糖-1,6-二磷酸组的ATP含量均逐渐升高(p<0.05)。结论1、已建立的反相高效液相法是一种稳定和灵敏度高的检测能量代谢物质的方法。2、几种细胞株主要的能量代谢依赖方式是不同的。3、腺苷能作为一种外源性能量补充剂,能提高已检测的所有细胞株的ATP。4、正常小鼠各脏器能量代谢物质的含量存在差异。5、在急性四氯化碳所致的肝纤维化和肾输尿管结扎所致的肾纤维化模型中,应用果糖-1,6-二磷酸能在体补充其能量代谢物质。