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背景:下呼吸道感染仍然是导致全球住院和死亡的主要原因之一。鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌是导致发展中国家致病率和死亡率的主要呼吸道细菌病原体。目的:本研究旨在开发一种检测快速、准确、灵敏、高通量、操作简便的PCR-膜层析杂交法,该方法可肉眼读取检测结果,能够用于呼吸道细菌的多重检测和半定量分析,实现鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等6种呼吸道病原菌的联检。方法:1.PCR-膜层析杂交法联检6种呼吸道细菌病原体的方法学建立。对于每种细菌病原体的引物,分别用五个不同的寡核苷酸(Tag)标记正向引物的5’末端,并用生物素标记反向引物的5’末端,正向引物末端与Tag之间用间隔物C3(间臂结构)连接。将各自互补的寡核苷酸(cTag)固定在膜条的测试区域中以形成6条测试线,对下呼吸道感染相关细菌,鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的目标DNA序列进行多重分析。通过单独应用生物素在每个膜条的末端形成一条内部控制线,以保证试纸条型生物传感器的正常功能。反向引物的5’末端的生物素与包被链霉亲和素的蓝色乳胶微球结合可产生信号。PCR扩增细菌DNA片段后进行膜条层析杂交时,带有寡核苷酸标记末端和生物素标记末端的目标DNA通过链霉亲和素-生物素相互作用与蓝色乳胶微球偶联,然后在膜条上与互补的寡核苷酸杂交,被捕获的蓝色乳胶微球在检测线和内部控制线上积累产生肉眼可见的蓝色条带。通过使用6种细菌标准菌株10倍倍比稀释的菌液提取DNA进行PCR扩增,扩增后进行膜条层析获得的一系列检测线颜色强度色谱图,从而判断PCR-膜层析杂交法检测6种细菌的最低检测限,并对细菌进行半定量分析。2.PCR-膜层析杂交法的临床应用。采用PCR-膜层析杂交法回顾性分析157例痰液标本,并与传统细菌培养方法进行比较,采用SPSS24.0统计学软件进行数据分析,用配对卡方检验计算两种检测方法的一致率,为了进一步评估PCR-膜层析杂交法检测PCR扩增产物的准确性,将所有PCR扩增产物进行DNA测序。结果:1.PCR-膜层析杂交法能特异性检测和鉴别鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等6种细菌,并且显示出较高的灵敏度和良好的特异性。PCR-膜层析杂交法中单种细菌的最低检出限为10-102CFU/mL,且6种细菌之间不存在交叉反应。2.对于157例临床样本的检测,传统细菌培养方法显示有鲍曼不动杆菌24例,大肠杆菌16例,肺炎克雷伯杆菌23例,流感嗜血杆菌5例,金黄色葡萄球菌15例,铜绿假单胞菌24例,半定量培养均大于++。同时,50例为阴性样本。107例细菌培养阳性的样本中,经PCR-膜层析杂交法检测11例被鉴定为2-3重病原体混合感染,96例被鉴定单重病原体感染,同时50例细菌培养阴性的样本经PCR-膜层析杂交法鉴定为阴性。PCR-膜层析杂交法定性检测结果与DNA测序的一致性为100%,kappa值为1.00。以细菌培养作为临床诊断金标准,PCR-膜层析杂交法的阳性预测值为89.7%,阴性预测值为100%。总的来说,PCR-膜层析杂交法和细菌培养方法检测157例临床样本的一致率为93.0%,两种方法检测107例阳性样本的一致率分别为鲍曼不动杆菌95.8%,大肠杆菌75.0%,肺炎克雷伯杆菌91.3%,流感嗜血杆菌80%,金黄色葡萄球93.3%,铜绿假单胞菌91.7%。结论:成功建立了可用于鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等6种呼吸道细菌病原体联检的PCR-膜层析杂交法,该方法简单、快速、高通量、灵敏、准确且极具成本效益。PCR-膜层析杂交法的诊断性能良好,适用于小型实验室和现场即时检测。