类鼻疽(Melioidosis)是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌)引起的一种新发的、正在扩散的人兽共患传染病。该疾病可通过消化道、呼吸道或经破损表皮传播,主要引起肺炎、肺部多发性脓肿,还可造成肝脏、脾脏等多脏器脓肿,如不及时治疗,可发展为急性败血症,危及生命。鉴于类鼻疽临床症状多样极易误诊、致死率高且潜伏期长,目前尚无有效疫苗,美国CDC已将类鼻疽菌提升为B类生物战剂严加防范。类鼻疽主要流行区域集中在热带和亚热带地区,包括东南亚、澳大利亚北部以及我国海南、香港、台湾等南海主要战略地带,严重威胁人类健康和公共卫生安全,因此深入研究类鼻疽菌的感染机制及致病机理,发展新的有效的防治策略迫在眉睫。天然免疫系统是机体抵御病原微生物侵袭的第一道防线。专业性吞噬细胞(如巨噬细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞等)作为天然免疫系统重要组成部分,能够通过吞噬作用吞噬病原菌形成吞噬体囊泡,随后吞噬体囊泡逐渐成熟酸化,并转运至溶酶体与其融合形成吞噬溶酶体,以杀灭降解病原菌。而作为一种兼性胞内寄生病原菌,类鼻疽菌为了实现在宿主细胞内的生存、感染和致病的目的,有效逃逸宿主细胞免疫清除也就成为类鼻疽菌与宿主之间生存斗争的关键。深入研究类鼻疽菌胞内感染机制揭示其致病机理,对于发展新的有效的类鼻疽防治具有十分重要的理论指导意义。类鼻疽菌侵入宿主细胞后,可以形成不与溶酶体融合的吞噬体,称为含类鼻疽菌囊泡(B.pseudomallei-containing vacuole,BCV),来逃避吞噬体-溶酶体降解途径,但其如何适应内部环境并操纵吞噬体转运过程仍不清楚。Rab蛋白被称为细胞内膜泡运输的关键调节因子,许多研究表明Rab蛋白参与了吞噬体的形成和成熟。因此,为了确定类鼻疽菌吞噬体在与囊泡运输通路的相互作用,本论文在类鼻疽菌感染过程中,初步对参与吞噬体转运的19种Rab蛋白进行定位和表达研究。发现类鼻疽菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞后Rab32表达上调并募集到BCV上,并且Rab32阳性BCV与多种晚期内体标记(Rab7、LAMP1和LAMP2)共定位,提示其具有晚期内体特性。进一步沉默Rab32后,类鼻疽菌与晚期内体标记定位减少,吞噬体逃逸增加,胞内细菌载量增多。同时在细胞中分别过表达Rab32不同活性突变型,发现过表达Rab32-WT和Rab32-Q83L能明显促进BCV的酸化及与组织蛋白酶CTSD的定位和成熟,从而限制细胞内类鼻疽菌的增殖。说明Rab32能够促进BCV与溶酶体融合使类鼻疽菌胞内生存受限。MicroRNA(mi RNA)是一类长度约20-25个核苷酸的小分子非编码RNA分子,结合于靶基因3’端非翻译区(UTR),具有转录后调控基因表达和翻译的功能。进一步,为了从miRNA调控感染免疫的角度探讨类鼻疽菌感染巨噬细胞后Rab32表达上调的分子机制,利用miRNA表达谱芯片分析了类鼻疽菌感染后miRNA表达谱发生的变化,发现在显著下调miRNAs中miR-30家族的成员被预测靶向Rab32 mRNA的3’UTR。通过qRT-PCR方法发现只有miR-30b和mi R-30c的下调对于类鼻疽菌的感染是特异性的。并且miR-30b和mi R-30c以Rab32为靶基因影响Rab32的表达及募集到BCV表面,从而调控BCV与溶酶体融合过程。近年来对于病原菌效应蛋白在病原-宿主相互作用过程中的调控机制研究一直是病原微生物感染免疫研究领域的热点和难点。与许多革兰氏阴性病原菌一样,类鼻疽菌借助其自身的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)将特异性效应蛋白注入宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路,从而促进其在细胞内的感染和定植。尤其是第三套Ⅲ型分泌系统(T3SS-3)效应蛋白在介导类鼻疽菌从吞噬体囊泡逃逸,避免被转运至溶酶体降解过程中至关重要。因此,为了进一步明确类鼻疽菌T3SS-3调控吞噬体囊泡转运的关键效应蛋白,我们针对目前推定的类鼻疽菌T3SS-3分泌的所有效应蛋白BopA、BopC、BopE、BapA和BapC使用同源重组的方法分别构建缺失突变株,并以之感染小鼠巨噬细胞RAW264.7观察胞内吞噬体囊泡逃逸情况以及胞内运动和增殖能力。筛选到有一个可能参与调控类鼻疽吞噬体转运的效应蛋白BapC。研究发现ΔbapC突变株在吞噬体中的逃逸延迟,通过充分利用相互作用蛋白质组学找到了BapC与宿主细胞骨架微管蛋白相互作用,不过并没有观察到BapC与微管蛋白在细胞内具有共定位,而是定位到细胞核中。进一步发现BapC缺失后类鼻疽菌在巨噬细胞和小鼠感染模型中的增殖受限,并导致宿主产生剧烈的炎症反应及各脏器损害。以上结果提示BapC可能在类鼻疽菌感染过程中扮演重要角色,综上所述,本论文以类鼻疽菌如何干扰宿主吞噬体转运,实现逃避胞内免疫清除作为研究出发点,重点围绕类鼻疽菌吞噬体在胞内的转运调控过程以及筛选T3SS-3调控吞噬体囊泡转运的关键效应蛋白。发现类鼻疽菌感染巨噬细胞过程中,miR-30b/30c表达下调,诱导Rab32表达上调。随后,在感染的早期阶段Rab32招募到类鼻疽菌吞噬体上,并有效促进BCV与溶酶体的融合,导致吞噬体酸化,激活CTSD的成熟,增强巨噬细胞对类鼻疽菌的杀伤和降解。同时类鼻疽菌T3SS-3效应蛋白BapC,能够协助类鼻疽菌逃离吞噬体,并能依赖微管蛋白入核,影响类鼻疽菌感染中宿主的免疫应答反应。这些研究发现有助于进一步理解类鼻疽菌与宿主相互作用机理,从而为预防和治疗类鼻疽菌感染提供重要的新思路和理论基础。