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目的:结肠癌的恶性增殖受到多种因素的影响,其中肿瘤血管生长对肿瘤的生长起重要作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)是一种重要的促血管形成因子,并且还能以自分泌的形式促进肿瘤细胞自身生长,在结肠癌的发展、转移及预后等方面均起着重要的作用。因此,阻断VEGF表达可抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖,是结肠癌基因治疗的一项重要策略。VEGF mRNA经不同的剪切方式可得到7种不同的同工型,在人类细胞中其氨基酸残基数分别为121、145、148、165、183、189、206 ,其中VEGF165表达广泛,是最重要的效应分子。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA (double-stranded RNA , dsRNA )引发的转录后基因沉默机制(post tanscriptional gene silencing, PTGS)。利用RNA干涉(RNAi)技术可设计出针对VEGF mRNA165特异的siRNA序列,阻断基因表达具有高稳定、高效率和高特异的特点,可望成为肿瘤基因治疗的新手段。因此,设计、构建VEGF165特异的RNAi表达体系,分析表达体系对结肠癌细胞增殖和肿瘤血管生成的影响,对探索结肠癌基因治疗的新途径具有重要意义。方法:第一部分:①针对VEGF165mRNA序列,筛选、设计、合成siRNA相关基因片段,构建高特异的siRNA表达载体pAVU6+27- VEGF165-siRNA,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。②脂质体法基因转染HCT116细胞,G418抗性筛选获得阳性克隆。半定量RT-PCR和Western blot法验证siRNA阻断VEGF基因表达的效率。第二部分:①应用MTT比色分析法和流式细胞技术观察siRNA阻断VEGF基因表达后HCT116细胞增殖及细胞周期分布的影响;②建立重组体转染HCT116细胞的荷瘤裸鼠模型,观察肿瘤生长情况;应用免疫组化法观察肿瘤血管生成和VEGF表达的改变。结果:①成功构建针对VEGF165mRNA序列siRNA表达载体:pAVU6+27- VEGF165-siRNA。②重组子脂质体法转染HCT116细胞,经G418筛选获得阳性克隆细胞,RT-PCR和Western Blot检测靶细胞VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达较对照组明显下降,其受抑制率分别为71.2%和66.6%(P<0.01)。③MTT分析结果显示实验组人结肠癌细胞的生长被明显抑制,细胞周期分布分析提示G0/G1期细胞比例增高,另一方面S期和G2/M期细胞比例降低,RNA干扰重组体明显促进肿瘤细胞G0/G1期