骨骼是人体重要的力承受器官。骨钙素是骨内除I型胶原蛋白以外含量最多的蛋白质,具有多个与羟磷灰石和钙离子结合的羧化谷氨酸位点,研究者认为骨钙素对骨骼形成及矿物质沉积有密切关系。但是骨钙素敲除小鼠骨量反而增加的实验结果表明骨钙素可能并非起到促进骨形成的作用。研究表明骨骼来源的非羧化骨钙素可以通过促进胰岛素、睾酮合成对机体能量代谢、性腺等功能进行反馈调节。在骨外组织中也可以检测到骨钙素m RNA的表达,如肝脏、肾脏、睾丸、卵巢、胰腺等。虽然非羧化骨钙素功能的研究取得了重大突破,但羧化骨钙素的功能仍不明确,骨钙素异位表达的细胞类型及其意义也有待于进一步研究。针对骨钙素的表达部位及其潜在功能这一科学问题,以分子影像技术为依托,采用构建基因过表达、基因敲除/敲低细胞模型等研究方法,研究骨钙素在雄性性腺中的表达情况并初步解释其功能,从而为解释羧化与非羧化骨钙素的具体功能提供新的实验依据和理论基础,对研究骨骼和其他器官之间交互调控也有着重要的意义。为了在动物整体水平研究骨钙素在骨外器官的表达情况,实验采用Luc酶标记骨钙素基因启动子,通过小动物分子影像技术检测转基因小鼠体内Luc酶的分布,间接反映小鼠体内不同器官中骨钙素启动子的活性。结果证明骨钙素启动子在睾丸组织中具有明显活性,且活性随着小鼠周龄的增长而增加。检测结果通过q PCR在基因水平进行验证,证实了在小鼠、大鼠、牛睾丸组织中确实有骨钙素基因的m RNA表达。IHC检测显示表达细胞为睾丸间质细胞。通过采用不同引物,排除了睾丸中骨钙素的表达为PMF-1通读表达和ORG干扰的可能。骨钙素基因中存在多种调控因子。为了研究睾丸间质细胞中骨钙素的调控表达情况,构建了通过Luc酶反映骨钙素基因启动子活性的稳定细胞系,在转基因细胞培养上清中加入VD3处理,检测细胞中Luc酶活性。同时,在正常细胞培养上清中加入不同浓度VD3,检测骨钙素基因表达量的变化情况。结果表明,睾丸间质细胞系培养上清中加入VD3后,骨钙素启动子活性和m RNA表达量均增加。血清中非羧化骨钙素具有促进睾酮合成的功能,为了阐明骨钙素在睾丸间质细胞中表达的功能,首先采用原核表达纯化非羧化骨钙素,并通过q PCR、ELISA方法检测外源非羧化骨钙素对睾丸间质细胞系(TM3)睾酮合成能力的影响。结果表明,在睾丸间质细胞中加入外源非羧化骨钙素可促进睾丸间质细胞中睾酮合成关键酶的表达和睾酮合成增加。为了研究骨钙素在睾丸间质细胞中表达的潜在功能,实验同时构建骨钙素基因过表达的睾丸间质细胞模型和骨钙素基因敲低细胞模型,采用q PCR、ELISA方法检测骨钙素过表达和敲低两种细胞系中睾酮合成关键酶和糖代谢酶的基因表达、睾酮合成量以及细胞增殖能力的变化。睾丸间质细胞过表达骨钙素会导致睾酮合成关键酶Cyp11a、STAR表达下降、SOX-9和Runx2基因表达量上升,但并不影响细胞增殖和糖代谢酶的表达。将睾丸间质细胞内源骨钙素敲低并没有对睾酮合成产生显著影响,但导致成软骨基因SOX-9表达下降60%。实验结果证明,外源加入非羧化形式骨钙素与细胞内源表达骨钙素功能相反。进一步构建了睾丸间质细胞特异性过表达骨钙素的转基因小鼠,在体水平分析睾丸间质细胞表达骨钙素基因的可能作用。小鼠睾丸组织特异性过表达骨钙素导致小鼠睾丸重量显著下降、睾丸曲细精管直径缩小和生精细胞脱落、睾丸组织内睾酮合成酶STAR表达下降,成软骨基因SOX-9表达量上升。上述结果提示睾丸间质细胞内源过表达骨钙素可能导致细胞发生脱分化或成软骨向分化,增加发生睾丸微石症的风险。为了探讨睾丸间质细胞表达骨钙素的羧化形式和功能,通过定量PCR方法证明睾丸及其间质细胞表达的维生素K依赖羧化酶显著高于骨组织和成骨细胞。利用法华林可以特异性阻断维生素K循环的特性,在正常睾丸间质细胞系和骨钙素过表达细胞系的培养上清中加入法华林,通过q PCR检测睾酮合成关键酶表达量的变化。同时增加通过CRISPR-Cas9技术构建的GGCX(维生素K依赖羧化酶基因)敲除细胞系作为平行对照组,并做同样检测。在正常睾丸间质细胞中加入法华林对细胞自身糖代谢,增殖和骨钙素表达没有影响,而骨钙素过表达组中STAR和Cyp11a表达以及睾酮合成回升,SOX-9和Runx2表达下降,同样,骨钙素过表达的GGCX敲除组中睾酮合成关键酶STAR和Cyp11a表达升高、SOX-9基因表达下降。上述结果说明睾丸间质细胞表达的骨钙素为羧化形式。综上所述,通过研究骨钙素的表达部位,发现睾丸间质细胞系中存在骨钙素基因m RNA和蛋白表达;且睾丸间质细胞中表达的骨钙素为羧化形式的骨钙素。睾丸间质细胞中过表达骨钙素导致睾酮合成关键酶表达量下降,进而导致睾酮合成下降;同时SOX-9和Runx2基因表达的升高也导致睾丸结石形成的风险增大。实验结果为羧化骨钙素的功能研究提供了新的线索。