槲皮素对羊茅中毒致羔羊心血管毒性与胃肠道菌群稳态的保护作用

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高羊茅是世界上种植最广泛的冷季型草,是一种具有良好抗旱性与抗逆性的理想型牧草。“被内生菌感染高羊茅”是指美国肯塔基31(Kentuky-31)品种的高羊茅感染对动物有毒的真菌内生菌Neotyphodium coenophialum。内生菌Neotyphodium coenophialum感染高羊茅时会产生一类麦角生物碱化合物,该化合物能够影响动物机体的食欲控制、心脏和血管功能、激素水平、肠道蠕动、肌肉收缩和身体温度调节功能,危及牲畜生命健康安全。“羊茅中毒”是指牲畜食用被内生菌感染的高羊茅后引起一系列临床疾病的总称。羊茅中毒能够导致牲畜毛发粗糙、消瘦、精神萎靡、呼吸和心率加快、直肠温度升高等症状,也能够导致心血管毒性,但羊茅中毒导致心血管毒性作用的具体机制仍不清楚。槲皮素又称洋葱素或槲黃素,是一种膳食中含量最丰富的黄酮醇,在心血管疾病中具有较强的抗氧化作用,因此槲皮素的心血管保护作用为防治羊茅中毒造成的心血管毒性提供线索。为探究槲皮素拮抗羊茅中毒致羔羊心血管毒性机制以及对胃肠道菌群稳态的影响,本试验选用24只杜泊羔羊随机分成4组(6只/组):E-,Q-组(未被内生菌感染的高羊茅种子组)、E+,Q-(被内生菌感染的高羊茅种子组)、E+,Q+组(被内生菌感染的高羊茅种子+4g/kg槲皮素组)和E-,Q+组(未被内生菌感染的高羊茅种子+4 g/kg槲皮素组),连续饲喂42 d的日粮。记录各组羔羊的采食量与饮水量、观察心脏病理组织学和超微结构变化、检测血清生化心功、肝功、肾功指标、血常规指标、血清中催乳素含量、心脏与主动脉组织的抗氧化水平、I、Ⅱ、Ⅲ相解毒代谢酶反应、NF-κB介导炎症反应、线粒体生物发生相关因子、线粒体动力学分裂融合蛋白的表达,线粒体自噬水平;血清中丁酸含量、瘤胃挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、总挥发性脂肪酸)浓度,以及瘤胃与粪便微生物菌群相对丰度和多样性进行检测。试验结果表明:(1)羊茅中毒导致羔羊生长速度缓慢,平均日采食量降低,血清中催乳素含量降低;饲料中槲皮素的添加减轻血常规指标中白细胞数量异常增多。槲皮素减轻羊茅中毒诱导心肌纤维断裂,缩小心肌纤维束间隙,减轻主动脉组织弹性纤维排列松散或断裂程度,缓解心血管结构损伤;槲皮素抑制羊茅中毒引起的血清心功能指标肌酸激酶(CK)与天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性升高,降低肝功能指标γ-谷氨酰转肽酶(GGT)活性增加趋势并增加肝功能指标白蛋白(TP)含量,表明槲皮素拮抗羊茅中毒致心血管结构损伤与心、肝功能损伤。(2)槲皮素缓解羊茅中毒诱导的心血管组织氧化应激,抑制氧化代谢产物(MDA和H2O2)含量增加并提高抗氧化酶(T-SOD、CAT、Cu-Zn SOD和T-AOC)活性。同时,槲皮素亦能缓解羊茅中毒诱导的心血管组织中核受体(AHR、CAR和PXR)的表达抑制,缓解Nrf2介导的Ⅱ相解毒酶干扰,增加Ⅲ相解毒酶(ABCC1和ABCB1)的表达,进而改善羔羊机体对羊茅中麦角生物碱的代谢作用,表明槲皮素缓解羊茅中毒导致的心血管氧化损伤与解毒代谢酶的干扰。(3)槲皮素通过抑制NF-κB介导的信号通路激活,降低TNF-α、NF-κB、p-NF-κB和促炎因子(IL-1β、IL-6和IL-18)表达,提高抗炎因子(IL-4、IL-10和P53)表达水平,减少心血管组织炎性细胞浸润,表明槲皮素拮抗羊茅中毒导致的心血管炎性损伤。(4)槲皮素激活PGC-1α介导的线粒体生物发生,促进相关因子(Nrf1、PRDX3和RAF1)的表达,缓解线粒体动力学稳态失衡,增加线粒体融合蛋白(MFN1、MFN2和OPA1)并降低线粒体分裂蛋白Fis1的表达,抑制Parkin/PINK信号通路介导的线粒体过度自噬,减轻羊茅中毒引起心血管线粒体功能损伤,表明槲皮素可以维持线粒体功能,发挥对羊茅中毒引起的细胞毒性的保护作用。(5)槲皮素可以调节瘤胃内挥发性脂肪酸的产生,缓解羊茅中毒导致的瘤胃内挥发性脂肪酸(异丁酸、丁酸和异戊酸)含量减少,增加瘤胃内与血清丁酸含量,激活PGC-1α表达,缓解羊茅中毒引起的心血管线粒体损伤。(6)槲皮素显著提高瘤胃与粪便菌群的Alpha和Beta多样性,并诱导拟杆菌门Bacteroidetes以及瘤胃球菌属Ruminococcus、Succiniclasticum及普雷沃菌属Prevotella相对丰度增加,缓解羊茅中毒对瘤胃与粪便菌群在门与属水平上相对丰度改变,表明槲皮素拮抗羊茅中毒对瘤胃与粪便微生物菌群稳态的干扰。综上所述,羊茅中毒可引起羔羊心血管线粒体损伤、线粒体过度自噬、激活NF-κB通路诱导炎症反应的发生及心血管氧化应激,导致细胞损伤;羊茅中毒也破坏羔羊瘤胃和肠道菌群稳态,干扰挥发性脂肪酸产生。槲皮素促进解毒代谢酶对麦角生物碱的代谢,增加瘤胃中挥发性脂肪酸含量,提高瘤胃与粪便菌群多样性,改善羊茅中毒对菌群相对丰度的抑制。
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