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性别发育是基本的生命活动过程，它是一个涉及多个基因时空表达的网络调控体系。性别决定与分化也是研究器官形成与分化的良好模式。尽管至今已提出一些理论来解释性别决定与分化过程，包括基因型性别决定、环境性别决定以及社会群体性别决定等，然而对其分子机制和进化规律还缺乏深入的认识。 黄鳝是我国淡水鱼中的一种具有天然性反转生理特性的鱼类，即由雌性、间性到雄性发育的过程；青鳉是一种小型卵生的淡水鱼，其有类似于人类的XY染色体。因而它们成为研究性别发育的良好模式生物，对其性别发育机制的阐明有助于人类认识自身，为性别相关疾病防治提供理论依据。本文在研究黄鳝性别分化基因和青鳉性别决定基因时，首次发现了黄鳝性别分化基因P450c17(CYP17)存在选择性剪接现象，同时也发现了青鳉性别主基因DMY以及Dmrt1存在类似的选择性剪接现象。 1．黄鳝P450c17基因的选择性剪接——克隆、结构与表达分析 利用SMART技术合成了不同性别黄鳝性腺cDNA，并采用RACE方法扩增得到了黄鳝四个CYP17全长cDNA(Genbank登录号为：AY224681-AY224684)分别为CYP17-a1(3312bp)、CYP17-a2(1934bp)、CYP17-b(1676bp)、CYP17-c(1121bp)。序列分析表明，它们3′端的序列各不相同，是通过选择性剪接或选择性加尾产生，编码了三种不同的蛋白质(517个氨基酸，512个氨基酸和159个氨基酸)。进一步分析表明，P45O结构域是高度保守的，尤其是靠近5’端。 根据上述全长基因设计编码区的特异引物进行组织表达谱分析，Rl’- PCR结果表明CYPI7基因的各种转录本在卵巢、间性性腺和翠丸中都有表达，在脑中仅有CYPI 7-c有少量的表达外，其它组织如心、肝、肾中都没有任何转录本的表达，说明该基因主要性腺中表达，与性别发育有极为密切的关系。 Northem杂交验证了各种转录本在三种性腺中的表达模式。从黄鳝翠丸、卵巢和间性性腺提取总RNA(各1 0 pg)，然后在1 .0%的琼脂糖凝胶电泳分离并转膜，以黄鳝CYPI 7-a2的3，.RACE产物(l .6kb，包含保守的P45o结构域)标记探针([a一32P]deTP)，在u耳队hyb(Ambion)公司的杂交液中42℃进行Northern杂交16小时以上，结果表明CYPI7基因主要是CYPI 7-al的表达(约3.3kb)，而且翠丸大于卵巢，二者都远远大于间性性腺。其次是相对较弱的CYP了7-b的表达(约1.7kb)，而在CYP了7-aj和CYP了7-b之间有更弱的CYPI 7-a2表达，而CYP了7-c的表达在该条件下没有信号。 为进一步深入研究CYP17基因在性别分化中的作用，我们采用了性腺切片进行组织原位杂交(In siru hybridization)。digoxigenin一UTP标记正义RNA探针和反义RNA探针包含黄鳝 CYP了7-a2(l .6kb)的P450结构域，即分别用SP6或T7 RNA聚合酶转录(SP6启动子转录得到的探针为正义探针，T7启动子转录得到反义探针)。据Boehringer操作指南首先进行性腺组织冰冻切片，立即42℃进行杂交，杂交信号用NBT/BCIP系统进行显色。结果表明CYP了7基因在生殖婿的上皮细胞特异表达，而在发育的生殖细胞中没有表达。另外杂交信号强度翠丸大于卵巢，两者都远远大于间性性腺，此结果与 Northem杂交结果相印证。 在邻接法(NJ法)进行脊椎动物CYP17蛋白的聚类分析时，采用dustalx(1 .81)软件进行序列的联配，并用bootstrap进行赋值，得到脊椎动物CYP17蛋白的系统发生树。结果表明哺乳动物属同一分支，而黄鳝CYP17蛋白特异地与鱼类属另一分支。 Southem杂交是进行基因组DNA特定序列定位。本实验从雌雄黄鳝血液中提取基因组DNA，10 pg基因组DNA用EcoRI酶消化，0.8%的琼脂糖凝胶电泳(Iv/cm)分离并转膜，以黄鳝CYPI 7-a2(l .6kb，包含保守的P45o结构域)标记探针([a一32P]deTP)，在u叮队hyb(Ambion)公司的杂交液中42℃进行SOuthem杂交，结果在约6.skb处得到与黄鳝CYP17基因同源的杂交信号。 空间结构为功能预测奠定基础，为此我们对黄鳝CYP17蛋白进行了空间结构分析。首先利用DNAstar软件对黄鳝CYP17蛋白进行二级结构预测表明该蛋白主要由Q螺旋和p折叠组成，尤其是4一25和35一57的两个跨膜Q螺旋，可能与其进行膜内外电子传递功能有关。根据现有的CYP17蛋白晶体结构，唯有P45OBM3与真核生物有相近的空间结构，采用比较建模法进行黄鳝CYP17一al蛋白的空间结构预测。构建了黄鳝CYP17空间结构模型，表明其功能活性区(血红素结合位点和底物结合域)高度保守，为该基因深入地功能分析奠定基础。 以上这些结果说明，黄鳝CYP了夕基因表达存在时空差异，与黄鳝天然性反转过程相一致，暗示它在性别分化中的潜在重要作用。2.青锵刀材Y和Dmrtl基因的选择性剪接分析 利用SMART技术分别合成了青鳄雌性和雄性性腺cDNA，在D材r和刀脚rtl基因的保守区设计引物，进行3.RACE分析。在mRNA水平上发现了青鳄D初了和Dmrtl基因3’端存在类似于黄鳝CYPI7基因的选择性剪接现象。 首次发现了青鳄D材y基因两个选择性剪接(D拟下“与D例子b)，而D材Ka存在多态性，产生两种转录本(。材Kal和刀泪子a2)。DMY三个转录本的产度分别是1342bp、1334bp和92lbp，相应编?