乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是全球主要的公共卫生问题之一,目前,全球约有2.4亿人为慢性乙肝感染者,每年约有60多万人死于慢性乙肝导致的肝硬化、肝癌等疾病。现有的基于干扰素和核(苷)酸类似物的治疗尚不能根治乙肝。本实验室前期在Gut期刊上报道了一株针对慢乙肝的治疗性鼠源单克隆抗体E6F6及其识别的核心靶点(HBsAg-aa119-125、SA线性表位),并基于该靶点设计出乙肝治疗性表位疫苗。本研究拟从单克隆抗体水平对该疫苗介导的体液免疫反应进行初步研究。由于非人灵长类(Non-Human Primate,NHP)与人的免疫球蛋白基因高度同源,接种疫苗后可以激起相似的免疫反应,常被用作疫苗评估的动物模型,本研究选择食蟹猴作为上述疫苗评估的模型。本研究初步建立了食蟹猴记忆B细胞体外刺激培养体系并对上述表位疫苗在食蟹猴中诱导产生的抗体及其功能和识别表位进行初步探索,其结果为该治疗性疫苗的评估提供参考。研究内容共分为以下四个部分:第一,基于记忆B细胞体外刺激培养的猴源抗体筛选系统的初步建立及HBsAg特异性猴抗筛选。本研究首先在原有的人记忆B细胞体外刺激培养体系的基础上,对食蟹猴记忆B细胞分选和刺激培养条件进行了初步确定,即采用人PanB和人IgM、人IgD两种负选磁珠联用的方式进行记忆B细胞的分选;记忆B细胞按起始培养数(5-10)个/孔和104个/孔的CD40L饲养细胞共同培养至含10%FBS、50 ng/mL hIL21的RPMI 1640培养基,该体系可以有效的刺激记忆B细胞分化为浆细胞;其次我们进一步验证了文献报道抗体扩增引物的有效性。利用该系统,从28个阳性培养孔中克隆出10株HBsAg阳性抗体。第二,HBsAg阳性抗体的功能评估。评估结果显示,5株抗体1-12H4、1-23、3-13、3-23H1、3-23H4与HBsAg具有较优的抗原结合活性且能被E6F6(针对HBsAg SA线性表位的鼠抗)明显阻断,同时这些抗体在HBV转基因鼠中都显示出明显的HBsAg和HBV DNA清除效果,其中1-23和3-23H1的病毒清除能力最为显著。第三,猴源抗体的进一步人源化改造及性质鉴定。利用IMGT数据库,将1-23和3-23H1抗体轻重链可变区的骨架(Framewrok region,FR)的非人源氨基酸定点突变为人源氨基酸,并最终通过性质评估筛选性质较优的人源化抗体。进一步对这些人源化的抗体进行性质鉴定,参比亲本抗体及E6F6人源化抗体(162),最终选出人源化程度为98.33%的M1D(亲本抗体1-23)及人源化程度为97.78%的M3D(亲本抗体3-23H1),这两株抗体很好地保留了亲本抗体的抗原结合及体内抗原清除能力。对M1D、M3D广谱活性测定结果显示,M1D、M3D对乙型肝炎病毒三种主要的基因型A型、B型、C型都有较强的结合活性。第四,对人源化抗体M1D、M3D与抗原的相互作用进行研究。确定了抗体与抗原结合的关键CDR区和关键的氨基酸位点以及识别的抗原核心表位,M1D结合的核心表位为TGPCKTCT(aa1 18-125),M3D结合的核心表位为CKTCT(aa121-125)。综上,该研究对基于SA线性表位的治疗性疫苗在食蟹猴中诱导产生的抗体进行了初步探索。获得了两株食蟹猴来源的人源化抗体M1D、M3D,在HBV转基因鼠中具有显著清除HBsAg和DNA的能力。基于M1D、M3D识别表位的研究证明,二者均识别SA表位,且核心表位与E6F6识别表位部分重叠,进一步揭示SA线性表位特异性的抗体能够介导高效的HBV病毒清除,该研究结果也为基于该表位的治疗性疫苗的有效性评估提供了一定的指导意义,可为乙肝治疗性抗体药物的开发提供候选分子。此外,该研究建立的方法也可为性能优良的类人抗体开发提供新的手段。