【摘 要】
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芍药（Paeonia lactiflora Pall.）是我国传统名花,具有较好的药用价值和观赏价值,同时对外界环境的适应能力较强,是挖掘植物抗逆基因的理想材料,但由于芍药种子具有上、下胚轴双重休眠的特性,繁殖较为困难,组织培养方面仍存在未解决的问题,尚未建立成熟的遗传转化体系,阻碍了芍药分子生物学的研究,因此,建立一种高效、快速的基因鉴定方法是十分必要的。本研究建立了一种农杆菌介导的芍药瞬时转化
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芍药（Paeonia lactiflora Pall.）是我国传统名花,具有较好的药用价值和观赏价值,同时对外界环境的适应能力较强,是挖掘植物抗逆基因的理想材料,但由于芍药种子具有上、下胚轴双重休眠的特性,繁殖较为困难,组织培养方面仍存在未解决的问题,尚未建立成熟的遗传转化体系,阻碍了芍药分子生物学的研究,因此,建立一种高效、快速的基因鉴定方法是十分必要的。本研究建立了一种农杆菌介导的芍药瞬时转化体系,对萌发时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度、Tween-20浓度、负压强度、共培养时间和受体材料这几种瞬时转化条件进行了筛选,并利用该体系瞬时过表达芍药抗逆基因Pl GPAT、Pl DHN2和Pl HD-Zip,通过检测其在低温、高温及干旱胁迫下的表达水平和生理指标,验证了瞬时转化体系的可行性,为芍药一些关键基因的功能研究提供思路和依据。主要研究结果如下:（1）以芍药组培苗和实生苗为瞬时转化受体材料,利用农杆菌介导法将含有GUS报告基因的植物表达载体p CAMBIA1301转入芍药幼苗,通过GUS组织化学染色法对瞬时转化条件进行了筛选,研究结果显示:以芍药组培苗为受体材料时,在农杆菌菌液浓度为1.2,添加200μmol/L AS和0.01%Tween-20的农杆菌重悬液中侵染萌发30 d的芍药组培苗24 h,并进行负压强度为10的处理后,在黑暗条件下共培养3 d,瞬时转化效率最高;以长出2-3 cm芽的芍药实生苗为受体材料时,在农杆菌重悬液中侵染12 h,其他瞬时转化条件不变的情况下,瞬时转化效率最高,可达93.3%,更适合后期芍药抗逆基因功能的研究。（2）构建芍药抗寒基因Pl GPAT、耐高温基因Pl DHN2和抗旱基因Pl HD-Zip过表达载体,利用农杆菌介导的芍药瞬时转化体系分别转化芍药实生苗,通过GUS组织化学染色鉴定发现,瞬时转基因芍药实生苗均出现明显的蓝色斑块,证明成功利用芍药瞬时转化体系将重组过表达载体转入芍药实生苗。（3）在低温、高温和干旱胁迫下,瞬时转基因芍药实生苗中的抗逆基因均被非生物胁迫诱导,基因表达量和各生理指标含量明显增加,其中抗氧化酶活性和有机渗透调节物含量明显高于对照组,SOD活性约为对照组的1.46倍、POD活性约为对照组的1.37倍、CAT活性约为对照组的1.22倍、可溶性糖含量约为对照组的1.2倍、脯氨酸含量约为对照组的1.15倍,MDA含量明显低于对照组,约为对照组的0.9倍,表明瞬时转化抗逆基因的芍药实生苗发挥其抗逆功能,验证了农杆菌介导的芍药瞬时转化体系可用于研究芍药抗逆基因的功能。
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