论文部分内容阅读
吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)是色氨酸分解代谢的第一限速酶,可通过介导色氨酸的耗竭及其代谢产物犬尿氨酸的积累来诱导T细胞和NK细胞的凋亡或功能紊乱,从而减弱机体的抗肿瘤免疫。因此,IDO1被认为是肿瘤免疫治疗药物的一个重要靶标。同时,作为有广阔发展前景的免疫治疗候选药物,吲哚胺2,3-双加氧酶1抑制剂,如Epacadostat和Indoximod等已经进入临床试验。尤其值得关注的是,小分子IDO1抑制剂与PD-1抗体的结合可以显著提高肿瘤治疗的客观反应率(ORR,objective response rate)。由于它是一种具有良好生物化学作用的单链催化酶,因此,IDO1被认为是小分子免疫治疗发展的一个极具吸引力的靶点。开发新型IDO1小分子抑制剂将会对临床肿瘤免疫治疗的发展产生积极影响。在第一部分实验中,为了发现和探索新型的靶向IDO1的小分子免疫治疗药物,我们通过PCR实验扩增人IDO1启动子上游区域1245 bp基因片段,将其插入到pGL4.20-basic载体中构建了 pGL4-IDO1-luc荧光素酶重组质粒。基于双荧光素酶报告基因方法建立IDO1抑制剂筛选模型,筛选能够下调肿瘤细胞中IDO1表达的天然活性小分子化合物。采用MTT、Western blotting和LDH等方法探讨阳性化合物的抗肿瘤作用及其对IDO1的调控机制。化合物川楝素(toosendanin,NS-180)能显著下调IFN-γ诱导的肿瘤细胞中IDO1表达而不能直接抑制IDO1的酶活性。在A549细胞中,川楝素可抑制IFN-γ诱导的STAT1的磷酸化和核转位,从而在转录水平下调IFN-γ诱导的IDO1蛋白表达。细胞阻抗分析和LDH释放实验表明,川楝素可促进NK淋巴细胞对A549细胞的杀伤作用。综上所述,筛选获得的天然小分子川楝素是一类新型高效的IDO1抑制剂,它可能成为靶向IDO1的肿瘤免疫治疗候选药物。在第二部分实验中,为了发现和探索新型的靶向IDO1的小分子免疫治疗药物,我们首先设计合成了一系列新型的小檗碱(berberine,BBR)衍生物,包括酯类、酰胺类和磺酸类化合物。以IDO1为靶点对BBR衍生物的活性进行了研究,检测其是否抑制IFN-γ诱导的IDO1启动子荧光素酶活性。构效关系分析表明,在位置9使用叔碳、季碳或者刚性结构基团进行取代,可能有利于增强其对IDO1启动子活性的抑制效力。与BBR相比,2f、2i、2n、2o、8b等化合物对IDO1启动子荧光素酶活性有较好的抑制作用,抑制率约为71-90%。Western blot实验进一步验证了它们在蛋白水平抑制IDO1的表达。而且,化合物2i和2n通过增强NK淋巴细胞对A549细胞的杀伤作用显示了其抗癌活性,这种抗癌活性是由于靶向下调IDO1的表达,而不是因为化合物本身对A549细胞的细胞毒性作用。初步的机制研究显示化合物2i和2n能够通过激活AMPK,抑制STAT1磷酸化,从而在转录水平下调IFN-γ诱导的IDO1表达。因此,我们认为化合物2i和2n是一种很有前途的新型的IDO1抑制剂,它们可能对临床肿瘤免疫治疗的发展产生积极影响。