经典Wnt信号通路(Wnt/β-catenin信号通路)是一类由分泌型糖蛋白Wnt介导的信号转导途径,在动物胚胎发育中参与调节细胞增殖与分化、背腹体轴建立、组织和器官形成,以及成体组织稳态的维持等一系列生理过程。其异常与发育缺陷、恶性肿瘤、代谢综合征、神经退行性病变等诸多人类疾病的发生和发展密切相关。因此,深入研究经典Wnt信号通路的分子调控机理,对相关疾病的诊治具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。经典Wnt信号通路主要通过提高细胞质内β-catenin的蛋白稳定性,促进其移位至细胞核而激活下游靶基因的表达。当细胞没有接收Wnt信号时,胞质内的β-catenin被由支架蛋白Axin、腺瘤性息肉病基因蛋白产物(adenomatous polyposis coli, APC)、糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)和酪蛋白激酶1 (casein kinase 1, CK1)等组成的降解复合物捕获,经泛素化后由蛋白酶体降解,故β-catenin无法进入细胞核激活靶基因的转录。当细胞外存在较高浓度的Wnt配体时,Wnnt能结合细胞膜上的受体,招募Axin移位至细胞膜,促使降解复合物解体。β-catenin不再受到降解复合物的控制,因此在胞质内累积并进入细胞核,结合转录因子T细胞因子／淋巴增强子因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF)促进下游靶基因的表达。由此可见,β-catenin在细胞核内的累积(nuclear accumulation)是经典Wnt信号通路激活的关键事件之一。然而,有关β-catenin核内累积的分子调控机制迄今仍知之甚少。LisH2 (Lisl Homology 2)是一个进化上高度保守的蛋白,早期研究显示其在细胞质与细胞核中均有定位,能够与RanBPM (Ran-binding protein M)蛋白相互作用。RanBPM作为支架蛋白,在细胞信号转导通路和细胞周期调控中发挥重要功能。但是关于LisH2的生化特性及其生物学功能至今仍不清楚。在本研究中,为深入了解LisH2的生物学功能及其与人类疾病的相关性,我们首先在TCGA (The Cancer Genome Atlas)数据库中进行生物信息学分析,结果显示LisH2 mRNA在结直肠癌组织中表达明显上调,小规模的临床样本研究也证实LisH2 mRNA和蛋白水平的确在结直肠癌组织中上升,提示LisH2可能参与结直肠癌的发生和发展过程。由于多条细胞信号通路异常与结直肠癌的发生发展密切相关,我们通过一系列监测细胞信号通路活性的报告基因实验,发现下调LisH2可特异性地抑制Wnt信号通路报告基因的活性。而且,下调LisH2显著抑制Wnt信号诱导的靶基因Axin2和CyclinDl的表达。这些结果表明LisH2可能是经典Wnt信号通路中一个正向的调节因子。为了阐明LisH2调节经典Wnt信号通路的分子机制,我们首先检测了该通路的关键分子β-catenin的水平。我们发现下调LisH2对β-catenin总体蛋白水平并没有明显的影响,但是却显著抑制β-catenin在细胞核中的水平。免疫荧光实验进一步证实降低LisH2表达减弱β-catenin在细胞核中的定位。在LisH2表达下调的细胞中,与细胞核内转录因子TCF4结合的β-catenin含量也明显降低。此外,我们发现LisH2同β-catenin类似,也受到Axin复合物的调控,Wnt信号能够通过抑制Axin复合物增强LisH2稳定和核内累积。以上结果表明LisH2通过促进β-catenin在细胞核中的累积,参与调控经典Wnt信号通路。为了探索LisH2调控β-catenin核内累积的分子机制,我们检测了LisH2与β-catenin的相互作用。GST沉降和免疫共沉淀实验显示LisH2通过其CRA结构域与β-catenin直接结合。外源表达野生型LisH2以及缺失LisH或CTLH结构域的LisH2突变体都能够成功挽救LisH2下调造成的表型,但缺失CRA结构域的LisH2突变体却无法挽救。进一步在细胞内过表达带有核定位序列的LisH2及其突变体,我们发现即使在Wnt信号未激活的条件下,促进LisH2的核内定位足以提高β-catenin在细胞核中的累积,但唯独缺失CRA结构域的LisH2突变体无此功能。这些结果表明LisH2通过CRA结构域与β-catenin结合,帮助其在细胞核内定位。为了研究LisH2调节经典Wnt信号通路的生理意义,我们在常用于经典Wnt信号通路研究的模式生物斑马鱼中进行实验。借助体视显微镜对胚胎发育形态的观察,以及原位杂交实验检测背腹体轴分子标记和Wnt靶基因的表达情况,我们发现下调LisH2导致胚胎发育出现腹部化,与β-catenin功能缺失造成的表型相类似。外源表达野生型LisH2或带有核定位序列的β-catenin均能挽救腹部化表型,但缺失CRA结构域的LisH2突变体不能挽救。以上结果表明LisH2通过促进β-catenin核内累积而影响经典Wnt信号通路,参与调控斑马鱼胚胎背腹体轴的发育。由于Wnt信号异常活化是结直肠癌发生和发展的重要原因之一,而我们发现LisH2在结直肠癌组织中高表达,因此我们进一步探索LisH2在结直肠癌发生和发展中的作用。在APC基因突变的结直肠癌细胞系DLDl和SW480中,敲低LisH2可有效下调核内β-catenin的水平。下调LisH2不仅降低Wnt报告基因活性和靶基因的表达,而且还抑制了癌细胞的增殖、生长和成瘤能力。这些研究表明LisH2可能通过促进β-catenin核内累积而影响经典Wnt信号通路,参与调控结直肠癌的发生和发展。综合上述研究结果,LisH2可能通过促进β-catenin在细胞核中的累积,参与调节经典Wnt信号通路,进而调控胚胎早期背腹体轴发育以及结直肠癌的发生和发展。这一研究有助于我们深入了解LisH2的生物学功能和经典Wnt信号通路的分子调控机理,为与该信号通路异常相关的人类疾病提供新的潜在治疗靶点。