酸性蛋白酶是一种适合在酸性条件(pH 1.0-5.0)下水解蛋白质的天冬氨酸蛋白酶。其主要来源于微生物分泌物和动物脏器,被广泛应用于食品、畜牧、医学、皮革以及水产加工等领域。微生物来源的酸性蛋白酶通常由曲霉属固体发酵获得,所用曲霉包括黑曲霉、红曲霉、宇佐美曲霉、米曲霉等,但其工业生产存在发酵周期长、劳动强度大、纯化困难等问题。而动物脏器来源的酸性蛋白酶主要从猪胃组织中提取获,存在提取效率低、生产成本高、来源受限等缺点。近年来,随着基因工程技术迅速发展,巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)作为表达外源蛋白的工程菌株越来越受到重视。鉴于其表达系统具有杂蛋白分泌较少、培养成本低廉、发酵工艺成熟等优点,已有多种外源蛋白在毕赤酵母系统中成功表达。然而目前,通过基因工程生产酸性蛋白酶的报道依旧较少且酶活较低。本研究通过对发酵豆制品进行宏基因组测序,从中获得米曲霉酸性蛋白酶基因pepA,序列分析结果显示,其基因长度为1 215 bp,共编码287个氨基酸,其中前20个氨基酸为信号肽。构建毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-pepA并转化毕赤酵母GS115菌株,获得重组表达菌株yz1。对yz1的摇瓶培养条件进行了优化,当初始pH为6、甲醇浓度为1%、诱导4天时,重组米曲酸性蛋白酶(PepA)活性达50.62 U/mL。SDS-PAGE结果表明,PepA的分子量约为50 kDa,且发酵上清液几乎无杂蛋白。PepA的酶学性质研究结果显示,其最适pH值为4.5,最适温度为50℃,Mn2+和Cu2+对其具有激活作用,而Fe3+、Fe2+与Ca2+则具有抑制作用。同时,根据Genbank上公布的猪胃蛋白酶原A基因(pA)序列(登录号:EF108301),合成其基因全长,长度为1 227 bp,共编码385个氨基酸,其中前15个氨基酸为信号肽。为研究α因子分泌信号肽对猪胃蛋白酶A(PA)表达水平的影响,构建了带有α信号肽的pPIC9K-pA1与去除α信号肽pPIC9K-pA2重组表达载体并分别转化毕赤酵母GS115菌株,获得PA重组表达菌株yz2和yz3。结果显示,yz3发酵上清液重组酶活性为112 U/mL,而yz2发酵上清液重组酶活性仅为20 U/mL,α信号肽的去除显著增加了 PA的表达水平。进一步对yz3的培养条件进行优化,当发酵液初始pH为6.5、甲醇浓度为0.5%、诱导9 d时发酵液的酶活可达252.63 U/mL,比优化前提高了 2.3倍。PA的酶学性质表征结果显示,其最适pH值为2.5,在pH 2.0-4.0之间具有较好的稳定性,最适温度为50℃,在45℃以下酶活力保持稳定。金属离子Mn2+和Cu2+对该酶具有激活作用,而Co2+与Ca2+则具有微弱的抑制作用。上述关于酸性蛋白酶在毕赤酵母中的异源表达、发酵优化及酶学性质的研究结果,为提高酸性蛋白酶的工业化应用奠定了基础。