目的:本文旨在通过对道地药材霍山石斛多糖生物合成中的关键酶GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPP)的研究,为霍山石斛多糖生物合成路径解析提供一定基础。方法:本研究以霍山石斛新鲜植株为原材料,比较优化了霍山石斛总RNA提取的方法,利用琼脂糖凝胶电泳、蛋白核酸微量定量仪及特异性PCR扩增对不同方法提取的RNA进行质量检测;通过Illumina平台进行霍山石斛的转录组测序,以了解其相关基因的表达情况,为寻找其体内合成次生代谢产物的核酸序列提供参考;针对分析结果及资料收集,实验课题选择霍山石斛GDP-甘露糖焦磷酸化酶进行基因克隆,设计特异性引物并选用Extaq酶进行PCR扩增,随后对目标基因进行电泳检测;将DNA条带从凝胶中切取下来并经琼脂糖凝胶DNA凝胶回收试剂盒处理后,用pGM-T Fast克隆试剂盒进行重组质粒构建,将包含目标基因的载体以热休克方法导入大肠杆菌DH5α中培养,培养出的菌落经PCR扩增确认后,在LB氨苄西林培养基中进行培养,培养菌群再次经PCR扩增确认目标基因后,用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒,在确定质粒浓度后对质粒进行测序,并对获得的目标基因cDNA进行生物信息学分析;使用pDONR 221作为入门克隆进行BP反应,继之以pDEST17作为表达载体进行LR反应来构建重组蛋白表达载体;利用qPCR技术检测霍山石斛中根、茎、叶、花不同组织部位中GMPP基因的表达情况。结果:RNA提取方法优化研究结果表明MCHAN法提取的霍山石斛总RNA条带清晰,无弥散现象、完整性好且无其它杂质污染。转录组测序,构建了17个cDNA文库,初步明确了霍山石斛转录组概况,发现了7种可能参与霍山石斛多糖合成的关键酶基因,包括蔗糖酶、蔗糖合成酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖酶与GDP-甘露糖焦磷酸化酶,为霍山石斛相关基因的克隆及验证功能提供生物信息学证据。霍山石斛GMPP基因克隆得到其cDNA序列全长1867bp,包含1245bp的开放阅读框,编码415个氨基酸;对序列分析表明霍山石斛GMPP序列与铁皮石斛、黄花石斛序列有99%相似性;进化树分析结果表明霍山石斛与铁皮石斛、黄花石斛等植物有较近的亲缘关系;通过BP和LR反应构建了霍山石斛GMPP重组表达载体,为后续诱导重组蛋白表达及重组蛋白功能验证提供基础;qPCR对霍山石斛中根、茎、叶、花不同组织部位中GMPP基因的表达情况检测结果表明GMPP基因在霍山石斛茎中表达量最高,其次是叶,然后是花,根中表达量最低,同时发现霍山石斛GMPP基因表达水平与其茎、叶、花、根中多糖含量呈高度相关性,这对研究霍山石斛多糖生物合成机理将起到积极的促进作用。结论:通过对霍山石斛RNA提取方法的优化研究得到一种简便、经济、高效的霍山石斛总RNA的提取方法,即MCHAN方法。解决了霍山石斛RNA提取的问题,为于后续转录组测序及分子克隆提供基础。通过对野生与栽培霍山石斛植株进行转录组测序,构建了17个cDNA文库,初步明确了霍山石斛转录组概况,为后续相关基因进行克隆及功能验证提供数据资料。对道地药材霍山石斛多糖生物合成中的关键酶GDP-甘露糖焦磷酸化酶的克隆及重组表达载体的构建进行初步研究,成功获得了霍山石斛GMPP体外表达载体,为下一步对重组蛋白功能活性验证提供依据。