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第1章引言脓毒症是机体对感染反应失调引起危及生命的器官功能障碍[1],由多种致病原因引起,以炎症细胞的过度激活和炎症因子大量产生的“炎症风暴”为特征。心肌损伤是脓毒症最严重、最致命的并发症之一,又被称为脓毒症心肌病（Sepsis-induced cardiomyopathy,SICM）或脓毒症性心功能障碍（Sepsis-induced myocardial dysfunction,SIMD）,其特点是心肌收缩和舒张功能障碍、左心室输出量下降。脓毒症引起心肌损伤及心功能障碍进一步加重组织微循环低灌注,引发恶性循环,是脓毒症死亡率居高不下的重要原因[2]。因此,深入阐释脓毒症心肌损伤的分子机制,为筛选新的治疗靶点提供理论依据,对提高脓毒症心肌损伤患者的治疗效果和延长患者存活时间均有重要的现实意义。目前研究认为脓毒症心肌损伤的发病机制包括炎症细胞浸润导致促炎和抗炎因子之间失衡、氧化应激增加、线粒体功能障碍、钙离子调节障碍等[3]。Adropin是由能量稳态相关基因（Energy homeostasis-related gene,Enho）编码的多肽,由76个氨基酸组成,氨基酸序列在不同物种间高度保守[4]。最初的研究发现,adropin的功能是调节能量平衡,促进葡萄糖和脂质代谢。随着研究的深入,越来越多学者发现adropin在心血管系统发挥独特的保护作用。尤其新近研究提示adropin参与抗炎[5]和抗氧化应激作用[6,7]。然而,adropin是否在脓毒症心肌损伤发挥作用目前尚未完全阐明。本课题组前期研究表明,adropin参与肥胖青少年内皮功能的保护作用[8],同时在病理性心肌肥厚动物模型中能通过抗炎,抗氧化应激发挥抗心室重构作用[9]。因此,我们推测adropin在脓毒症心肌损伤中可能发挥抗炎和抗氧化应激作用。本研究从分子、细胞和动物水平来多层面探讨adropin在脓毒症心肌损伤中的作用及其机制。第2章Adropin在脓毒症心肌损伤模型中表达水平降低目的:1)探讨脓毒症心肌病患者心脏组织Enho基因的表达情况。2)构建脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导脓毒症心肌细胞损伤模型及探讨adropin表达水平。3)构建脓毒症心肌损伤动物模型及探讨adropin的表达变化。方法:1)利用生物信息学方法,从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库下载脓毒症心肌病芯片GSE79962数据集,使用R和Perl软件得到基因表达矩阵,提取Enho基因的表达数值,分析Enho基因在脓毒症心肌病组和正常对照组心肌组织中表达是否存在差异。2)体外实验利用LPS诱导H9C2心肌细胞损伤,用全自动生化仪检测细胞上清心肌细胞损伤标志物肌酸激酶同工酶（Creatine Kinase-MB,CK-MB）和乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）的水平,用q RT-PCR检测细胞内IL-6、TNF-α的m RNA水平,用Western-blot检测细胞内adropin蛋白水平。3)体内实验采用C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS构建脓毒症模型,利用超声心动图评估小鼠心脏功能,苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining,HE）和生化仪检测血清心肌损伤标志物（CK-MB和LDH）评估心脏损伤程度,Western-blot和ELISA检测adropin在心脏组织和血清中的水平。结果:1)生物信息学提示,与正常对照组相比,脓毒症心肌病患者心脏组织Enho基因表达水平降低（P＜0.05）。2)体外实验中,LPS刺激H9C2细胞24小时后细胞上清心肌损伤标志物CK-MB和LDH水平升高（P＜0.05）和细胞内炎症因子IL-6和TNF-αm RNA表达水平升高（P＜0.05）,提示模型构建成功。LPS模型组心肌细胞内adropin蛋白表达水平降低（P＜0.05）。3)体内实验中,小鼠腹腔注射LPS后24小时超声心动图评估心脏功能提示LPS组左心室射血分数显著降低（P＜0.05）,HE染色和血清CK-MB和LDH检测提示有心肌损伤表现。血清ELISA检测结果LPS组炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高（P＜0.05）,而adropin血清水平和心脏组织内蛋白水平显著降低（P＜0.05）。结论:1)Enho基因在脓毒症心肌病患者心脏组织表达水平降低。2)Adropin蛋白在体内和体外脓毒症心肌损伤模型中明显下降,提示其在脓毒症心肌损伤中可能发挥重要保护作用。第3章Adropin在脂多糖诱导心肌损伤中的保护作用及机制目的:1)体外细胞水平研究重组adropin在脂多糖诱导心肌细胞损伤中的作用及相关机制。2)体内动物实验探讨重组adropin在脂多糖诱导小鼠心肌损伤中的作用及相关机制。方法:1)使用生物活性的重组adropin34-76多肽干预H9C2细胞。细胞分组:空白对照组（Control组）、模型组（LPS组）、LPS+Adropin低剂量组（LPS+Adropin-L）、LPS+Adropin中剂量组（LPS+Adropin-M）、LPS+Adropin高剂量组（LPS+Adropin-H）,用不同浓度重组adropin预处理30min,LPS刺激24小时后用CCK-8实验检测adropin对细胞活性的影响,并明确adropin干预的最适浓度。2)细胞分组:Control组、Adropin组、LPS组和LPS+Adropin组。LPS+Adropin组是用adropin预处理H9C2细胞30min,然后加入LPS（终浓度10ug/ml）诱导24小时,用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的水平。3)用丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）检测试剂盒检测各组细胞内MDA和SOD的水平。4)用Western-blot方法检测各组细胞内炎症因子（IL-6和TNF-α）、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl2和Cleaved-caspase3）的蛋白水平。5)动物分组:Control组、Adropin组、LPS组、LPS+Adropin组。用LPS（10mg/kg）构建脓毒症心肌损伤模型,LPS+Adropin组用重组adropin34-76尾静脉注射0.2mg/kg预处理小鼠30min,然后腹腔注射LPS（10mg/kg）处理24小时。用超声心动图评估各组小鼠心脏功能,ELISA方法检测血清炎症因子水平,全自动生化仪检测血清中CK-MB和LDH的水平。6)取小鼠部分心肌组织行HE染色评估各组心肌组织损伤情况。7)检测心脏组织内MDA和SOD的水平,Dihydroethidium（DHE）染色评估各组小鼠心脏组织内ROS水平。8)Western-blot方法检测各组心肌组织内炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）蛋白水平、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl2和Cleaved-caspase3）蛋白水平。结果:1)CCK-8结果提示在LPS诱导H9C2细胞损伤模型中,与Control组相比,LPS组H9C2细胞活性显著降低（P＜0.05）,而给予重组adropin34-76预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin-M（100ng/ml）组H9C2细胞活性显著提高（P＜0.05）。2)流式细胞检测H9C2细胞内ROS水平显示,与Control组相比,LPS组细胞内ROS水平显著升高（P＜0.05）,而给予adropin（100ng/ml）预处理后,与LPS相比,LPS+Adropin组细胞内ROS水平显著降低（P＜0.05）。3)Western-blot检测各组细胞内相关蛋白结果显示,与Control组相比,LPS组诱导H9C2细胞内炎症因子（IL-6和TNF-α）的蛋白水平显著升高（P＜0.05）,而给予adropin（100ng/ml）预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组细胞内炎症因子（IL-6和TNF-α）的蛋白水平明显降低（P＜0.05）。检测各组细胞内凋亡相关蛋白（Bax,Bcl2和Cleaved-caspase3）结果显示,与Control组相比,LPS组细胞内Bax和Cleaved-caspase3蛋白水平显著升高（P＜0.05）,Bcl2蛋白显著降低（P＜0.05）。然而给予adropin（100ng/ml）预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组细胞内Bax和Cleaved-caspase3蛋白水平显著降低（P＜0.05）,相反Bcl2蛋白水平明显升高（P＜0.05）。4)小鼠心脏超声心动图显示,与Control组相比,LPS组左室射血分数（LVEF）和左室缩短率（LVFS）显著降低,而给予adropin预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组LVEF和LVFS具有明显升高（P＜0.05）。5)HE染色结果发现,与Control组相比,LPS组心肌水肿明显,有心肌断裂和炎性细胞浸润,而给予adropin预处理后,心肌组织水肿好转,心肌排列较整齐,炎性细胞浸润减少。6)血清ELISA检测炎症因子水平结果显示,与Control组相比,LPS组IL-1β、IL-6和TNF-a水平显著升高（P＜0.05）,而给予adropin预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组血清炎症因子水平（IL-1β、IL-6和TNF-a）显著降低（P＜0.05）。7)DHE染色结果显示,与Control组相比,LPS组心肌组织ROS水平显著升高（P＜0.05）,而给予adropin预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组心肌组织内ROS水平显著降低（P＜0.05）。8)检测心肌组织内MDA和SOD水平结果显示,腹腔注射LPS后小鼠心肌组织内MDA含量显著升高,而SOD水平显著降低（P＜0.05）。我们给予adropin预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组小鼠心脏组织内MDA水平显著降低,而SOD水平明显升高（P＜0.05）。9)Western-blot检测小鼠心肌组织内相关蛋白结果显示,小鼠腹腔注射LPS后,小鼠心肌组织炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）蛋白水平显著升高（P＜0.05）,而给予adropin预处理后可显著降低LPS诱导的心肌组织内炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）蛋白水平。检测各组心脏组织内凋亡相关蛋白（Bax,Bcl2和Cleaved-caspase3）结果显示,与Control组相比,LPS组心肌组织内Bax和Cleaved-caspase3的蛋白水平明显升高,而Bcl2蛋白水平显著降低（P＜0.05）。然而给予adropin（0.2mg/kg）预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组心肌组织内Bax和Cleaved-caspase3的蛋白水平显著降低,而Bcl2蛋白水平明显升高（P＜0.05）。结论:1)体外细胞水平,重组adropin34-76多肽降低LPS诱导H9C2细胞内氧化应激水平、减轻细胞内炎症反应和发挥抗细胞凋亡作用。2)在体动物实验证明,重组adropin34-76多肽可改善LPS诱导小鼠的心脏功能,降低心脏组织内氧化应激水平,减轻心脏组织内炎症反应和降低细胞凋亡作用。第4章Adropin通过Nrf2/ARE信号通路改善脂多糖诱导心肌损伤目的:1)探讨Nrf2/ARE信号通路是否参与脓毒症心肌损伤的作用机制。2)证明Adropin通过上调Nrf2/ARE信号通路改善脓毒症心肌损伤。方法1)在动物水平上,动物分组:Control组、Adropin组、LPS组、LPS+Adropin组。利用Western-blot方法检测各组小鼠心肌组织Nrf2、Gpx1和Nqo1相关蛋白表达。2)在细胞水平上,细胞分组:Control组、Adropin组、LPS组、LPS+Adropin组。利用Western-blot方法检测各组细胞内Nrf2、Gpx1和Nqo1相关蛋白表达。3)利用Nrf2抑制剂ML385预处理细胞进行回复实验。细胞分组:Control组、LPS组、LPS+Adropin组、LPS+Adropin+ML385组。LPS+Adropin+ML385组用adropin和ML385共同预处理H9C2细胞30min,后加入LPS处理细胞24h。（1）检测各组细胞内MDA和SOD的水平。（2）用DHE方法检测各组细胞内ROS的水平。（3）利用q RT-PCR方法检测各组细胞内炎症因子（IL-6和TNF-α）m RNA的表达水平。（4）Western-blot方法检测各组细胞内相关蛋白的表达水平。结果:1)在动物模型上,与Control组相比,LPS组小鼠心肌组织Nrf2、Nqo1和Gpx1蛋白水平降低（P＜0.05）,而给予adropin预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组Nrf2、Nqo1和Gpx1蛋白水平显著性升高（P＜0.05）。2)在细胞模型上,LPS诱导H9C2细胞后导致Nrf2、Nqo1和Gpx1蛋白水平降低（P＜0.05）,而给予adropin预处理后,与LPS组相比,LPS+Adropin组细胞内Nrf2、Nqo1和Gpx1蛋白水平显著性提高（P＜0.05）。3)与LPS+Adropin组相比,LPS+Adropin+ML385组细胞内ROS和MDA水平明显升高（P＜0.05）,而细胞内SOD的水平显著降低（P＜0.05）。4)与LPS+Adropin组相比,加入Nrf2抑制剂ML385后,LPS+Adropin+ML385组炎症因子（IL-6和TNF-α）的m RNA和蛋白水平显著性升高（P＜0.05）。5)Western-blot结果发现,加入Nrf2抑制剂ML385后,与LPS+Adropin组相比,LPS+Adropin+ML385组Nrf2/ARE通路相关蛋白（Nrf2、Nqo1和Gpx1）表达水平显著性降低（P＜0.05）。6)免疫荧光共聚焦结果发现,与Control组相比,LPS组胞浆和胞核内Nrf2表达水平降低,给予Adropin预处理后可增加细胞胞浆和胞核内Nrf2的表达,然而给予Nrf2抑制剂ML385后,与LPS+Adropin组相比,LPS+Adropin+ML385组胞浆和胞核内Nrf2的水平降低。结论1)Nrf2/ARE信号通路参与脓毒症心肌损伤的发生、发展。2)Adropin可能通过上调Nrf2/ARE信号通路改善心肌细胞的氧化应激,在LPS诱导心肌细胞损伤中发挥保护作用。