论文部分内容阅读
甘肃鼢鼠(Eospalaxcansus)隶属于啮齿目(Rodentia),鼹形鼠科(Spalaacidae),鼢鼠亚科(Myospalactinae),凸颅鼢鼠属(Eospalax),广泛分布于甘肃黄土高原、宁夏南部、陕西、青海东部等地区,在林地、农田、荒坡等地栖息,是一种典型的地下鼠。由于终生于地下低氧洞道中生活,使它们进化出许多相似的特征,在形态及生理方面与地面鼠存在显著差异,进化成了地下鼠独特的低氧适应机制。氧是动物生存的必需条件,低氧会对动物造成损伤甚至导至死亡。脑是动物机体中高耗氧的器官,占总耗氧量的20%-30%,对缺氧高度敏感。细胞缺氧状态下可以产生氧依赖性转录激活因子即低氧诱导因子(HIF),HIF的活性主要由氧通过调节HIF-1α来进行,HIF-1α是依赖于生长因子的细胞生长所必须的,在缺氧状态下,抑制HIF-1α的表达可加速细胞死亡。哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞周期调控、增殖、细胞生长、分化等多个方面起到重要作用,可整合细胞外信号,磷酸化下游靶蛋白,如S6K1及4E-BP1,来影响蛋白质翻译与基因转录,从而参与调控细胞增殖、生长等过程。mTOR信号通路作为生长、发育、代谢、免疫、癌症等生理活动的主要调控者,当受到外界刺激时mTOR信号通路被激活,mTOR磷酸化下游的靶蛋白4E-BP1(真核翻译启动因子4E结合蛋白1),解除4E-BP1对EIF4E(真核翻译启动因子4E)的抑制作用,使EIF4E募集40S核糖体亚基与mRNA5’端帽子结合,开始翻译蛋白质。相关研究表明,细胞在缺氧状态下蛋白合成受到影响,甚至会引起细胞的凋亡,影响机体的正常生理代谢。甘肃鼢鼠生活在低氧环境中,仍然能够维持正常的生理机能,我们推测,mTOR信号通路在甘肃鼢鼠的低氧应激中发挥重要作用。为此,本研究以甘肃鼢鼠为研究对象,将SD大鼠作为对照,利用实时定量PCR技术和Westen Blot技术检测HIF-1α及mTOR信号通路中mTOR、4E-BP1、EIF4E在21%、10.5%和6.5%氧浓度下甘肃鼢鼠与SD大鼠脑中mRNA水平和蛋白水平的表达情况,利用HE染色和TUNEL染色甘肃鼢鼠及SD大鼠三种氧条件下的脑组织,观察脑组织中细胞形态变化及细胞凋亡。以上实验所得结果如下:1.HIF-1α、mαO 及其下游因子4E-BPI和EIF4E mRNA在甘肃鼢鼠脑中的表达情况:在21%和10.5%氧浓度下,HIF-1αa在甘肃鼢鼠脑中mRNA的表达高于SD大鼠,21%氧浓度下显著高于SD大鼠。甘肃鼢鼠脑中HIF-1α在6.5%的氧浓度下表达比21%和10.5%的氧浓度下表达量有显著降低。随着氧浓度降低,HHIF-1α在SD大鼠中表达量呈现上升趋势,但不同浓度之间HIF-1α的表达量差异并不显著。mTOR在21%、10.5%及6.5%的氧浓度下,甘肃鼢鼠脑中mRNA表达量极显著高于SD大鼠,甘肃鼢鼠在6.5%的氧浓度下mTOR表达量显著性高于在21%和10.5%氧浓度下的表达量。SD大鼠在6.5%氧浓度下显著升高,10.5%氧浓度下的表达量与21%氧浓度没有显著差异。4E-BP1在甘肃鼢鼠脑中mRNA表达量随着氧浓度的降低而降低,且三组之间存在极显著差异,相同氧浓度下,4E-BP1表达量在甘肃鼢鼠和SD大鼠呈极显著差异,在21%和10.5%氧浓度下极显著高于SD大鼠,6.5%的氧浓度下,甘肃鼢鼠表达量显著低于SD大鼠。EIF4E在甘肃鼢鼠脑中mRNA表达量随着氧浓度的降低而降低,6.5%氧浓度下极显著低于21%氧浓度,与10.5%氧浓度差异不显著。SD大鼠在三种氧浓度下差异不显著,在21%氧浓度下,甘肃鼢鼠EIF4E表达量极显著高于SD大鼠,10.5%氧浓度高于SD大鼠,在6.5%的氧浓度下,甘肃鼢鼠略低于SD大鼠,但均无显著性差异。2.HIF-1α、4E-BP1和EIF4E在甘肃鼢鼠大脑中蛋白的表达情况:甘肃鼢鼠中HIF-1α蛋白在10.5%氧浓度下表达显著高于21%氧浓度,6.5%氧浓度下变化不明显,略高于21%氧浓度。随着氧浓度降低,SD大鼠中表达量逐渐增加,6.5%氧浓度下表达量显著高于21%和10.5%氧浓度下的表达量。在不同氧浓度下,SD大鼠HIF-1α蛋白表达量始终比甘肃鼢鼠低,21%和10.5%氧浓度下极显著低于甘肃鼢鼠。随着氧浓度降低,4E-BP1磷酸化蛋白在甘肃鼢鼠中的表达呈现下降趋势,差异显著;4E-BPI磷酸化蛋白在SD大鼠中表达呈增加趋势,6.5%氧浓度下表达量与21%和10.5%之间呈现极显著差异。在21%氧浓度下,甘肃鼢鼠的表达量显著高于SD大鼠,10.5%氧浓度下低于SD大鼠,但差异不显著,在6.5%氧浓度下极显著低于SD大鼠。随着氧浓度降低,EIF4E蛋白在甘肃鼢鼠中的表达量无明显的变化,而SD大鼠中,在6.5%氧气浓度下的表达量相比21%和10.5%氧浓度下的表达量显著性升高,10.5%氧浓度下略低于21%氧浓度,但无显著差异。3.在低氧应激下,甘肃鼢鼠和SD大鼠脑组织HE染色及细胞的凋亡检测根据HE染色结果,在6.5%氧浓度下,甘肃鼢鼠与SD大鼠相比细胞受低氧的破坏较小,只是细胞质皱缩改变细胞体积,并未发生炎症等;SD大鼠在6.5%氧浓度下细胞有炎性浸润。根据TUNEL的实验结果,发现低氧刺激下,甘肃鼢鼠和SD大鼠脑细胞的凋亡不明显。以上研究结果表明,低氧刺激诱导甘肃鼢鼠HIF-1α表达,激活mTOR信号通路,通过调节mTOR的mRNA表达量增加,降低甘肃鼢鼠4E-BP1和EIF4E mRNA的表达量,说明低氧刺激下,mTOR在转录水平的高表达,降低了4E-BP 磷酸化蛋白的表达,降低了EIF4E的转录,但EIF4E在蛋白水平表达变化不显著。HE染色结果发现在6.5%氧浓度下SD大鼠脑细胞有炎性浸润,甘肃鼢鼠细胞未发现此类现象,证实甘肃鼢鼠与SD大鼠相比有更好的低氧耐受性。甘肃鼢鼠在分子机制水平与SD大鼠相比有不同的调节机制,这是长期进化所造成,蛋白质翻译是细胞当中最消耗能量的过程之一,为了适应低氧,甘肃鼢鼠降低体内依赖于EIF4E的蛋白质的翻译速率来减少能量的消耗,将可用的能量用来维持体内重要的生理功能,更好的保护甘肃鼢鼠脑组织细胞不受低氧破坏。