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目的细菌生物膜(bacterial biofilm)是粘附在物体表面上由细菌自发形成的具有结构性的聚合物基质。生物膜可保护细菌不受抗菌药物的作用,并能降低机体免疫功能和细胞的吞噬作用,使细菌耐药性明显提高,给临床治疗带来极大困难。美国疾病控制与预防中心的专家研究表明,65%-80%的人类细菌感染与生物膜相关,50%的院内感染与医疗器械装置上的生物膜相关。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是临床重要致病菌,也是生物膜感染常见的病原菌,常引起皮肤黏膜及多种组织器官的化脓性炎症,是医院内交叉感染的重要病原菌之一。生物膜形成能力是决定金黄色葡萄球菌医疗器械感染发生的重要毒力因子,而病原菌在植入的医疗装置上形成生物膜是导致患者发病和死亡的主要原因。在金黄色葡萄球菌感染中,尤其是慢性感染中,亟待我们寻找新的、以生物膜为靶向的的药物。近年来,香豆素类化合物由于其生理活性的多样化而引起了广泛关注,我们前期化学合成了多个系列的新型香豆素类衍生物,并筛选出了若干具有明显抗金黄色葡萄球菌活性的目标化合物,然而截止目前,香豆素类衍生物抗细菌生物膜活性的研究尚不多见,其抗金黄色葡萄球菌生物膜的分子机制也完全不清楚。本课题以临床常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为研究对象,评价了新型香豆素衍生物对其生物膜形成的抑制活性,并深入研究了抗MRSA生物膜的作用靶点及分子机制,有望为临床治疗金黄色葡萄球菌生物膜感染开发新的药物和提供新的作用靶点。方法1.筛选生物膜形成能力较强的金黄色葡萄球菌菌株:使用刚果红琼脂平板初步筛选能够形成生物膜的菌株,平板上能够形成干燥,发黑发亮的菌落的菌株为产膜阳性菌株,然后在96孔板中培养生物膜,使用结晶紫染色法半定量的检测阳性菌株的成膜能力,荧光染色观察其生物膜形成过程。2.测定香豆素衍生物DCH抗MRSA(USA300)生物膜活性:采用微量稀释法与平板计数测定DCH对USA300的MIC和MBC,使用结晶紫染色法观察不同浓度DCH对生物膜形成的抑制及对成熟生物膜的作用。3.DCH对大鼠体内生物膜形成的作用:在SD大鼠膀胱放入插管并注射1×107CFU USA300菌液,制备大鼠尿道感染模型,于感染后的1h、24h及48h给予不同浓度的DCH,3天后脱颈处死大鼠,取出插管轻洗后超声涂平板计数CFU,同时取尿液,膀胱和肾脏研磨后涂平板计数CFU。4.DCH对生物膜相关基因表达的影响:USA300与不同浓度的DCH共培养3h后收集各组菌液,离心后用溶菌酶及溶葡菌素裂解细菌,提取细菌总RNA,去除基因组DNA后反转录成为cDNA,荧光实时定量PCR检测icaA和atlA的基因表达。5.蛋白质组学分析DCH可能的作用靶点:采用重同位素相对与绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术比较分析DCH处理前后的细菌蛋白表达差异,推测可能的作用靶点。6.DCH与ArgR蛋白亲和力的检测:利用处理好的芯片通过PlexArray HT(V3版)生物分子相互作用分析仪对样品进行实时监测分析,通过SPRi分析新型香豆素化合物与argR蛋白结合的动力学和亲和力参数。7.DCH与ArgR蛋白分子对接:用溶液界面扩散法培养化合物DC H单晶,采用Modeller in Discovery Studio 3.5软件进行多重序列比对后,筛选出相似度最高的大肠埃希菌argR蛋白结构作为金黄色葡萄球菌argR蛋白同源模建模板,采用SWISS-MODEL的自动模式进行同源模建。在DCH和argR蛋白分子3D结构文件及参数文件基础上,选择Lamarekian遗传算法,通过Autodock计算得到化合物分子与argR靶蛋白结合时配体在活性口袋中的分布,以及与有关氨基酸残基的相互作用。结果1.选取成膜能力较好的USA300作为后续实验供试菌株:刚果红实验筛选出能够形成生物膜的5株金黄色葡萄球菌,结晶紫染色进一步筛选出成膜能力最强的MRSAUSA300菌株。2.DCH能够抑制MRSA USA300生物膜形成,并能一定程度上消除成熟生物膜:实验结果显示化合物DCH在MIC浓度以下也能明显的抑制生物膜的形成(P<0.001),并且,DCH对成熟的生物膜的具有一定的清除作用。3.DCH能够抑制MRSA USA300在大鼠体内形成生物膜:结果显示,DCH能明显抑制USA300在大鼠体内插管上形成生物膜的细菌数量,CFU平板计数结果还表明在DCH给药组动物尿液、膀胱及肾脏中的细菌数量也明显下降(P<0.001)。4.DCH能抑制生物膜相关基因的表达:在生物膜形成过程中,由ica基因座编码的PIA蛋白和atlA编码的AtlA蛋白发挥着重要作用,RT-PCR结果显示DCH分别在1/8MIC和1/4MIC时就能显著抑制atlA和icaA的表达(P<0.01)。5.DCH抗生物膜作用与细菌精氨酸代谢通路密切相关:利用iTRAQ定量分析技术,对空白对照组MRSA和DCH处理组MRSA USA300共计1647个蛋白进行分析,结果发现DCH能导致244个蛋白表达差异,其中表达上调的有97个,表达下调的有147个。在表达下调的蛋白中,差异倍数最大的前五位蛋白依次是鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨酸脱亚胺酶、免疫球蛋白G结合蛋白A、甘氨酸分裂系统蛋白H、氨基甲酸激酶。通路分析显示鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨酸脱亚胺酶和氨基甲酸激酶是MRSA细菌精氨酸代谢通路的关键酶,由arc基因簇编码,该基因簇的表达受精氨酸抑制因子(argR)的调节,推测DCH通过作用于argR发挥抗生物膜作用。6.DCH结合精氨酸抑制因子(argR)的亲和力测定:根据GenBank公布的细菌argR编码基因序列设计引物,构建argR表达克隆,并纯化了argR蛋白。SPRi分析结果显示化合物与argR结合信号明显,且随着argR浓度的增大结合信号变强;化合物DCH与argR相互作用亲和力常数为5.66×10-7 mol/L。7.香豆素化合物DCH与ArgR蛋白分子对接:利用孵育的化合物DCH晶体和同源模建的argR蛋白3D结构,选取不同的蛋白区域用Auto Dock程序进行对接,对接结果在0.1 nm的RMSD标准下分组,然后选取对接能和结合能最低且对接操作重复次数最多的构象,综合所有对接结果确定DCH结合的活性位点在185位的甘氨酸残基,分子对接值为-5.07。结论新型结构香豆素化合物能明显抑制体外MRSA生物膜,减少感染动物体内细菌的数量和生物膜的形成;其作用机制主要通过与精氨酸抑制因子结合,从而抑制其活性,降低细菌精氨酸代谢通路关键酶(精氨酸脱亚胺酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶和氨基甲酸激酶)的表达。本研究结果提示阻断精氨酸代谢通路将是抗细菌生物膜领域的一个全新机制,也为新型抗耐药细菌药物研制提供了的新的思路。