喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，位居头颈部上皮源性恶性肿瘤的第2位，占全身肿瘤的1.2％～1.6％。近年来，世界多数地区喉癌的发病率及死亡率均有明显增高趋势，严重威胁着人类的健康与生命。虽然近几十年来传统的治疗方式如手术、放疗、化疗等已有很大改进，提高了患者的5年生存率，但手术治疗往往严重破坏患者的喉功能而致残；放疗仅对早期喉癌疗效好，对于大多数就诊时即为中、晚期或治疗后又出现复发、转移的患者往往效果不佳；而化疗又由于其严重的毒、副作用常使得患者不能耐受治疗，从而使这些治疗方式仍受到极大限制。因此，积极寻求治疗喉癌的新途径成为广大耳鼻咽喉科研究者面临的新课题。近年来，随着对肿瘤发生机理研究的不断深入，针对肿瘤发生机制多环节而起作用的新型抗肿瘤药物不断发展，新的抗癌药物不断应用于临床，但因存在不少急需解决的问题，其临床应用前景仍受到很大限制。而以在维持肿瘤的生长中起重要作用的端粒酶为靶点的端粒酶抑制剂和促进肿瘤细胞凋亡的凋亡诱导剂等，因其作用机制广泛，潜在的毒性反应较轻，已引起肿瘤研究者的广泛关注。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDIs)是近年来发现的一类新的靶向抗肿瘤药物，它主要通过调节组蛋白的乙酰化状态来改变染色质结构，进而引起相关基因转录，使肿瘤细胞的形态和功能发生改变，最终导致细胞增殖抑制、诱导分化、凋亡以及端粒酶活性抑制等一系列结果而达到治疗肿瘤的目的。丁酸钠(sodium butyrate，SB)是食物纤维在结肠内发酵过程中产生的一种无毒的四碳短链脂肪酸，是HDIs中的一类小分子化合物。体外实验证实，丁酸钠能抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导细胞分化和凋亡，并且在诱导凋亡过程中，还能有效地抑制细胞端粒酶活性表达，具有广泛的抗肿瘤效应。进一步研究表明，丁酸钠对人前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌裸鼠移植瘤均有明显的生长抑制及诱导凋亡作用，且对机体无明显毒副作用。这些研究结果提示丁酸钠有望成为一种高效、低毒的凋亡诱导剂和端粒酶抑制剂在肿瘤治疗中发挥作用。目前对丁酸钠抗肿瘤作用的研究已涉及消化系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、神经系统及骨肿瘤等相关系统肿瘤，但丁酸钠对头颈部肿瘤影响的报道较少，有关其对喉癌作用的研究，迄今国内、外尚无文献报道。随着细胞培养方法的发展与普及，应用体外培养的癌细胞寻找新抗癌药物的研究已逐渐成为最重要的初筛手段之一。Hep-2为人喉上皮样癌细胞系，因其保留了大部分人喉鳞癌的生物学特性，已被广泛用于喉癌诊断、治疗的体外研究。为探讨丁酸钠在喉癌治疗中的作用，本研究在体外培养Hep-2细胞的基础上，采用免疫组化技术、流式细胞术及多种分子生物学技术观察了丁酸钠对Hep-2细胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影响并探讨其发生机制，为药物治疗喉癌拓展新的思路和方法。机体内部环境与体外环境有着很大的差异，体外实验结果并不能确切反映药物在体内对肿瘤的杀伤情况。为进一步明确丁酸钠经体内代谢后对肿瘤的影响，本研究在体外实验的基础上，以Hep-2细胞株建立人喉癌裸鼠皮下移植瘤模型，应用适当浓度的丁酸钠进行分组治疗实验，观察丁酸钠的抑瘤作用以及荷瘤裸鼠的毒性反应，并探讨其发生机制，为药物的开发、应用提供有价值的实验依据。本研究分为以下三部分。第一部分丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡的影响方法1．采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl terazolium，MTT)比色法测定经0.625、1.25、2.5、5、10mmol／L丁酸钠分别作用12、24、36、48、60、72h后Hep-2细胞增殖活性的改变，并于倒置显微镜下观察细胞形态变化。2．应用透射电镜观察经2.5mmol／L丁酸钠作用48h的细胞超微结构变化。3．采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucl-eotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling，TUNEL)技术分别检测经2.5mmol／L丁酸钠作用0(对照)、24、48、72h的细胞凋亡情况，统计细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)。4．分别提取经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h的细胞DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，显示凋亡细胞DNA片段化。5．采用流式细胞术分别检测经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h的细胞凋亡率及细胞周期分布。6．分别制备经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h的细胞爬片，采用免疫细胞化学技术检测细胞Ki-67抗原和Survivin蛋白表达情况。7．统计学处理：应用SPSS13.0统计软件作统计学处理。MTT法采用两因素方差分析加LSD法两两比较，TUNEL法、流式细胞术和免疫细胞化学检测均采用单因素方差分析加LSD法两两比较。以α=0.05作为检验水准。结果1．丁酸钠作用后细胞的增殖活性受到明显抑制，不同浓度组间(P＜0.01)、不同时间组间(P＜0.05)均存在显著性差异。10mmol／L丁酸钠作用72h后细胞生长抑制率达70.43％。丁酸钠作用后细胞的形态发生改变，且随药物浓度增加、作用时间延长而更显著。2．2.5mmol／L丁酸钠作用48h，透射电镜下显示核染色质浓缩、边集及凋亡小体等典型的凋亡细胞超微结构改变。3．2.5mmol／L丁酸钠作用48、72h，琼脂糖凝胶电泳均可见清晰的DNA梯状条带。4．TUNEL法显示，2.5mmol／L丁酸钠作用24、48、72h后细胞AI由作用前的2.27±1.18分别增加至13.63±1.90、22.25±3.56和33.50±2.75，不同时间组间差异有显著性(P＜0.01)。5．流式细胞术显示，随丁酸钠作用时间延长，细胞凋亡率逐渐增加(不同时间组间有显著性差异，P＜0.01)，G0／G1期细胞比例逐渐升高(P＜0.01)，S期细胞比例逐渐降低(P＜0.01)，而G2／M期细胞比例无明显变化(P＞0.05)；细胞增殖指数(proliferation index，PI)降低趋势明显(P＜0.01)。6．丁酸钠作用后，细胞Ki-67抗原和Survivin蛋白表达均受到抑制，随丁酸钠作用时间延长，Ki-67和Survivin阳性细胞平均光密度(mean optical density，MOD)值均逐渐降低，不同时间组间均有显著性差异(P＜0.01)。第二部分丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性及端粒酶三组分mRNA表达的影响方法1．采用端粒重复序列扩增(telomeric repeat amplification protocal，TRAP)-银染法检测经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h的Hep-2细胞端粒酶活性，并应用凝胶图象分析系统对检测结果进行半定量分析，研究丁酸钠对Hep-2细胞端粒酶活性的影响。2．采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h后细胞端粒酶三组分的mRNA表达情况，并对检测结果进行半定量分析，研究丁酸钠对Hep-2细胞端粒酶三组分表达的影响，以期了解丁酸钠影响细胞端粒酶活性的作用部位。3．统计学处理：应用SPSS13.0统计软件作统计学处理。采用单因素方差分析加LSD法两两比较。以α=0.05作为检验水准。结果1．丁酸钠作用后Hep-2细胞端粒酶活性降低。经2.5mmol／L丁酸钠作用24、48、72h后细胞端粒酶活性分别比药物作用前下降了25.36％、61.11％、86.68％，不同时间组间有显著性差异(P＜0.01)。2．经2.5mmol／L丁酸钠作用24、48、72h后细胞端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)mRNA表达水平分别比药物作用前下降了20.92％、55.09％、75.80％，不同时间组间有显著性差异(P＜0.01)；而端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)和端粒酶相关蛋白(human telomerase associated protein 1，hTP1)mRNA表达水平在各时间点无明显改变(P＞0.05)。第三部分丁酸钠对人喉癌裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究方法1．选用4-6w龄BALB／C-nu／nu雌性裸小鼠12只，于裸鼠右腋部皮下接种Hep-2细胞，建立人喉癌裸鼠移植瘤模型。成瘤后随机分为对照组和实验组，每组6只，治疗组每d向肿瘤组织局部注射丁酸钠，剂量为2.2mg／g体质量；对照组注射同体积PBS(0.01M，pH7.4)。共治疗4w。2．每d观察裸鼠的精神、饮食及活动状况。每w测量瘤体大小及裸鼠体质量，绘制肿瘤生长变化曲线，进行药物毒性评价。治疗结束时处死小鼠，剥除肿瘤称重，计算抑瘤率。光学显微镜下观察肿瘤及心、肝、肺、脾、肾等重要脏器变化。3．应用透射电镜观察移植瘤超微结构变化。4．采用TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况，统计细胞凋亡指数。5．采用免疫组化技术检测移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白表达情况，并对染色结果进行定量分析。6．采用TRAP-银染法检测移植瘤端粒酶活性，并对检测结果进行半定量分析。7．采用RT-PCR技术检测移植瘤端粒酶三组分mRNA表达情况，并对检测结果进行半定量分析。8．统计学处理：应用SPSS13.0统计软件作统计学处理。采用独立样本的t检验。以α=0.05作为检验水准。结果1．与对照组相比，实验组肿瘤生长较慢，肿瘤体积小于对照组，且随治疗时间延长，这种抑制效果更加明显。治疗结束时，两组瘤体积、瘤质量均存在显著性差异(P＜0.05)，体积抑瘤率和质量抑瘤率分别达58.81％和60.33％。2．光镜下，实验组肿瘤组织内坏死面积明显大于对照组，细胞异形性较对照组小，分化程度稍高于对照组，可见核固缩等凋亡表现。3．透射电镜下，实验组可见染色质浓缩、边集等典型的凋亡细胞超微结构改变。4．与对照组相比，实验组肿瘤组织中凋亡细胞明显增多，两组AI分别为：3.10±0.37、29.70±1.84，组间有显著性差异(P＜0.01)。5．实验组Ki-67抗原和Survivin蛋白表达均低于对照组。两组Ki-67阳性细胞MOD值分别为：0.278±0.012、0.186±0.100；两组Survivin阳性细胞MOD值分别为：0.149±0.007、0.098±0.009，组间均有显著性差异(P＜0.01)。6．实验组端粒酶活性明显低于对照组。两组端粒酶活性灰度值分别为：3858.00±412.67、2018.83±269.84，组间有显著性差异(P＜0.01)。7．与对照组比较，实验组hTERT mRNA表达明显减弱，两组hTERT mRNA表达相对光密度(relative optical density，ROD)值分别为：0.60±0.05、0.26±0.03，组间有显著性差异(P＜0.01)；而两组hTR mRNA和hTP1 mRNA表达水平无显著差异(P值均＞0.05)。8．治疗过程中，裸鼠未见明显不良反应，各组末体质量(final body weight，FBW)／初体质量(initial body weight，IBW)均＞0.8，无毒性反应。各组心、肝、肺、脾、肾等重要脏器均无肿瘤转移及器质性改变。结论本文采用免疫组化技术、流式细胞术以及多种分子生物学技术首次检测了丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞及人喉癌裸鼠移植瘤的增殖、凋亡、细胞周期、Ki-67抗原、Survivin蛋白表达、端粒酶活性及端粒酶三组分mRNA表达的影响，得出如下结论：1．丁酸钠对Hep-2细胞具有增殖抑制作用，这种抑制作用呈时间剂量依赖性。2．丁酸钠对Hep-2细胞具有诱导凋亡作用，这种作用存在时间依赖性。3．丁酸钠能下调Hep-2细胞Ki-67抗原表达，且呈时间依赖性。此作用可能是其抑制细胞增殖的机制之一。4．丁酸钠能下调Hep-2细胞Survivin蛋白表达，且呈时间依赖性。其对细胞的诱导凋亡作用可能是通过下调Survivin表达而实现。5．丁酸钠参与Hep-2细胞周期调控，使细胞阻滞于G0／G1期。丁酸钠对细胞的增殖抑制、诱导凋亡及端粒酶抑制作用可能均与其G0／G1期阻滞有关。6．丁酸钠能抑制Hep-2细胞hTERT mRNA表达，并下调其端粒酶活性，二者均呈时间依赖性；而对hTR mRNA和hTP1 mRNA表达无影响。提示丁酸钠对Hep-2细胞端粒酶活性的抑制作用可能是通过下调hTERT基因表达而实现。7．成功构建了人喉癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型，证实丁酸钠能抑制喉癌移植瘤生长，且对机体无明显毒、副作用。8．与体外实验结果相似，丁酸钠能下调喉癌裸鼠移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白表达；并诱导细胞凋亡；同时下调hTERT mRNA表达而抑制端粒酶活性。9．本研究首次从体内外证实了丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞及人喉癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用，其机制可能与阻滞细胞周期于G0／G1期、下调Ki-67抗原及Survivin蛋白表达、诱导细胞凋亡、下调hTERT mRNA表达而抑制端粒酶活性、进而抑制细胞增殖有关。为丁酸钠的临床研究提供了有价值的实验资料。